已烯雌酚单克隆抗体的制备研究.pdfVIP

摘 要 本试验合成了己烯雌酚的人工免疫原及包被原，采用杂交瘤技术制备了抗己烯 雌酚的单克隆抗体，并通过以单克隆抗体为基础建立的间接竞争ELISA法对单克隆 抗体作了初步评价。 己烯雌酚人工免疫原 (或包被原)的合成共分三步:第一，己烯雌酚与4-澳丁 酸乙醋反应合成己烯雌酚一单一丁酸乙酣基一醚，其经制备型TLC纯化制备:第二，己 烯雌酚一单一丁酸乙醋基一醚经皂化水解得己烯雌酚一单一狡基丙基一醚:第三，采用混合 酸配法将己烯雌酚一单一狡基丙基一醚与牛血清蛋白或鸡卵清白蛋白交联，最终合成免 疫原(813,818)及包被原(909,1009)。采用TLC,HPLC,H-NMR,MS等分 析技术，对反应进程进行监控，并对目的产物进行鉴定。最终交联结合物经紫外分 析，免疫原813,818及包被原909,1009的结合比分别为 1:28,1:34、1:7,1:13. 4只BALB/c小鼠，腹腔注射免疫原813的乳化制剂，10011/1只，以后间隔10 日免疫一次，10011/1只/次，腹腔注射。5免后，血清效价达1:12800即进行融合。 选2号鼠进行融合。采用化学融合技术及显微克隆技术，最终筛选到5株分泌 抗DES特异性抗体细胞株 (7B6,1G10,4B10,4E4,2C7)。选用7B6株，获取 腹水效价达1.024x107，亚型为IgGI= 用7B6上清杭体建立间接竞争ELISA方法，经优化最终条件初定为包被原1009 (1:12800)，7B6上清 (1:1000)，辣根过氧化物醉标记羊抗鼠抗体 (1:8000)， 非平衡抑制反应(板外反应过夜、板内反应1h).OPD为显色底物，显色时间30min. ELISA测定系列DES标准溶液，建立标准曲线:y=-31.67x+95.892(r-0.9829)， 线形范围:1-250nglml。己烯雌酚的ICS。约为500pg/孔左右，LOD=10pg/?L(lng/ 孔)。7B6单抗对二苯乙烯类药物己烷雌酚、己二烯雌酚及己烯雌酚的体内代谢结 合物己烯雌酚一单一葡萄糖酸配的交叉反应较高，与17B一雌二醇无交叉反应。 关键词:己烯雌酚，单克隆抗体，间接竞争 顺反异构 英文缩写及中、英文对照 ACPI atmosphericpressurechemicalionization 大气压化学离子化 Br-M TLC中点物质 (己烯雌酚一单一丁酸乙醋荃一醚) Br-U TLC上点物质 (己烯雌酚一双一丁酸乙酷基一醚) BSA bovineserumalbumin 牛血清白蛋白 C cis- 顺式 DES diethylstilbestrol 己烯雌酚 DES-BCPE DES-bis-carboxyproxyl-ether 己烯雌酚一双一狡基丙基一醚 DES-BEBE DES-bis-ethylbutyrate-eth二 己烯雌酚，双一丁酸乙酣基，醚 DES-MCPE DES-mono-carboxyproxyl-ether 己烯雌酚一单一狡基丙基一醚 DES-MCPE-BSA 免疫原 DES-MCPE-OVA 包被原 DES-MEBE DES-mono-ethylbutymte-ether 己烯雌酚一单一丁酸乙醋基一醚 DES-MG diethylstilbestrol-momo-glucuronide 己烯雌酚一单一葡萄糖酸醉 DIEN dienoestr