实时荧光定量PCR对丙肝RNA检测的影响因素.docVIP

精品论文 参考文献 实时荧光定量PCR对丙肝RNA检测的影响因素 刘永胜 隆元英 （江油市人民医院检验科 四川江油 621700） 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）23-0334-01 丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV，简称丙肝)为单正链RNA病毒，是丙型肝炎的病原因子，常引起肝炎慢性化。目前，HCV-RNA检测是判断HCV感染最可靠、最特异的方法，已成为HCV感染的确诊方法[1]。因为血中HCV含量仅为HBV的千分之一，加之其免疫学标志仅有抗-HCV一项，而单独抗HCV阳性不能诊断HCV现症感染，也不能作为临床选择抗病毒治疗和监测疗效的依据，只有结合HCV-RNA结果才能达到上述目的。但由于HCV-RNA检测受到多种因素的影响，比如实验室条件、标本、核酸提取及反转录过程以及不同仪器、不同试剂等可使同一份标本检测的结果相差很大，甚至达到1～2个数量级。 1.实验室条件影响因素 由于基因扩增检验对靶核酸有一个指数扩增过程，因而有大量的扩增产物的出现，这种扩增产物极易对以后新增的扩增反应产生“污染”，因此必须对扩增检验实验室进行严格分区。根据卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)规定“临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区，如使用全自动分析仪，区域可适当合并。”可以看出临床实验室条件对PCR扩增的重要性。实验室分区主要是为了避免发生交叉污染，因此在进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至扩增产物分析区，即使实验室的清洁也应按这一方向进行[2]。 2.标本影响因素 2.1 抗凝剂的影响 用于丙肝RNA测定最好使用EDTA抗凝全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除。如使用血清标本，则需尽快（2小时内）分离血清。 2.2 溶血标本的影响 在抽血过程中，难免会因为某些原因而引起部分标本溶血。由于溶血标本中存在的血红蛋白可以抑制Taq酶的活性，致使定量结果偏低，甚至出现假阴性结果。虽然目前大多数荧光定量PCR试剂盒使用核酸提取柱提取RNA,该方法操作简便快速，有实验表明，即使存在高浓度血红蛋白等干扰物质在用柱抽提的过程中被完全去除，为模板的核酸得到了高度纯化，从而可以避免样本溶血对实验结果的影响[3]。但是血细胞破裂会有大量核糖核酸酶（RNsae）释放而使提取模版的RNA降解，这必然导致定量结果降低，因此被检样品决不能溶血。 2.3 脂血标本的影响 理论上，脂血因素可造成HCV-RNA的检测结果偏低，主要原因有：其一，未经处理的脂血标本在加样过程中因脂肪颗粒占有一定体积而引起血清加样量相对减少；其二，脂肪或其代谢产物也能与Taq酶相互作用，抑制Taq酶的活性，扩增效率明显降低，导致检测结果降低。但在较高水平的病毒载量的标本中，扩增效率与HCV-RNA定量检测水平不发生明显的数量级改变，而在低水平的病毒载量的标本中，脂血标本对检测结果有明显的干扰作用[4]。可见，脂血标本确实存在一定的影响，因此通过嘱咐患者在采血前一天清淡饮食，第二天清晨抽取空腹血，来尽量避免标本形成脂血很有必要。 2.4 标本的保存 由于RNA为单链，极不稳定，且易被RNase所降解，因此应在取血后尽快提取RNA，如不能做到，则需要分离出血浆或血清进行冷冻保存，短期（1-2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃。有研究表明，-20℃存放 7个半月后临界标本完全降解而其他标本结果稍有下降[5]，因此标本不宜保存太长时间。 3.核酸提取及反转录过程的影响因素 3.1 核酸提取又称标本处理，这一阶段人为因素影响最大，因此要求需由具有专门经验和经过培训的人员进行操作，操作人员应穿工作服，戴一次性手套并经常替换。 3.2 由于RNA病毒检测较一般DNA病毒检测复杂，在裂解HCV颗粒，提取RNA，沉淀RNA，反转录中均有很多影响结果因素需要注意，其中最重要的是防止RNase污染和提取不充分。比如在标本处理过程中，加完提取液A、B及样本之后，应在漩涡混合器上充分混均，最好不用吸头吹打，因吸头混合过程中吸头内外粘附一些液体，造成部分RNA丢失，可使结果