丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建.pdfVIP

华南理工大学学报(自然科学版) JournalofSouthChina of V01．37No．6 University 第37卷第6期 Technology Science June2009 2009年6月 (Natural Edition) 丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建木 王斌潘力 郭勇 (华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006) 摘要：以米曲霉(Aspergillusoryzae)RIB40的基因组DNA为模板，聚合酶链式反应 (PcR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件，依次连接到载体pUCll9上， 构建了米曲霉的重组表达载体pNMA．将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的 启动子下，得到表达栽体pNMA-RML，通过却口I酶切线性化转化米曲霉宿主菌A．oryzae ONLl．其培养7天的培养液的上清液在以三 niaD300，得到整合型的阳性转化子A．oryzae 丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈，碱滴定法酶活测定表明培养液酶活 可这2．5U／mL，培养液上清液的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)图 谱在相对分子质量32500处有RML的特征条带．这说明RML已经在米曲霉中成功表达， 同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的． 关键词：米曲霉；外源基因表达；米赫根毛霉脂肪酶；硝酸盐还原酶；标记基因 中图分类号：Q782 文献标识码：A 米曲霉(Aspergillusoryzae)是丝状真菌中应用 非常普遍的种属，具有高效的蛋白分泌表达能力，不 产生黄曲霉毒索等有毒物质，应用历史悠久，是公认 米曲霉表达系统主要应用于米曲霉自身生理状态的 的GRAS菌，广泛应用于食品酿造行业、工业酶制剂研究一J．国内对米曲霉表达系统的研究尚未见报 行业．目前为止，利用米曲霉表达异源蛋白的水平可 道．本研究选用高效的基因表达元件构建米曲霉的 达3g／L…，与真核蛋白的优秀表达系统毕赤酵母的 外源蛋白表达系统，并对其进行初步鉴定，为利用米 表达水平相当拉J．除此之外，米曲霉蛋白表达系统 曲霉高效表达外源蛋白打下基础． 具有完善的蛋白翻泽后修饰机制，其模式接近于高 1材料与方法 等真核生物，能高效实现蛋白质的肽链剪切、糖基 化、形成二硫键、折叠成特定空间结构等翻泽后修 1．1 材料 饰．因而，构建高效的米曲霉外源蛋白表达系统的 1．1．1菌株和质粒 研究日益受到重视． oryzae 米曲霉营养缺陷型宿主菌(Aspergillus 目前关于米曲霉表达系统的研究主要集中于启 动子、筛选标记基因等的鉴定方面．已确定的高效启 动子包括淀粉酶基因(amyB)口j、糖化酶基因 (glaA)HJ、葡萄糖苷酶基因(agdA)∞J、酪氨酸酶基工大学生物科学与工程学院微生物酶工程实验室惠 因(船ZD)哺】等的启动子，高效的筛选标记基因包括赠．大肠杆菌Ecoli 收稿日期：2008—09-05 宰基金项目：国家自然科学基金资助项目 第6期 王斌等：丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建 载体质粒购自大连宝生物工程有限公司． 质体转化和转化