人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 范红渠 周卫兵 郝鲁峰 邵 磊 王智勇 [摘要]目的:构建表达入nm23-H1基因的重组腺病毒载体，并在人胚肾293细胞中进行鉴定。方法:以 重组质粒pcDNA3.1-nm23-H1中提取的nm23-H1基因为模板，采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片 段插入穿梭质粒pShuttle-CMV，并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-C MV-nm23-H1，电转化 已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1，用Lipofectamine转染293细 胞，制备携带人全长nm23-H1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-nm23-H1。大量扩增Ad-nm23-H1病毒颗 粒，并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测nm23-H1基因在293细胞中的转录。结果:经PCR、酶切鉴定及 DNA测序结果证实pShuttleCMV-nm23-H1及pAdEasy-nm23-H1质粒正确构建，纯化后的Ad-nm23-H1 病毒颗粒感染性滴度为109.5(3.4×109)CCIDs/ml，经RT-PCR扩增出的基因片段，与目的片段大小一致。结 论:已成功构建了表达nm23-H1重组腺病毒载体，为肿瘤的基因治疗提供了依据。 关键词:nm23-H1 ;重组腺病毒;构建;鉴定 R782 A 1672-2973(2012)01-0005-05 Construction and identification of recombinant adenovirus vector containing human nm23-H1 gene FAN Hong-quZHOU Wei-bingHAO Lu-fengSHAO Lei WANG Zhi-yong 基金项目:湖北省襄阳市重点科技攻关计划项目(2007117) 范红渠 襄阳市东风汽车公司襄樊医院口腔科 湖北 441004 周卫兵 襄阳市东风汽车公司襄樊医院口腔科 湖北 441004 郝鲁峰 襄阳市东风汽车公司襄樊医院口腔科 湖北 441004 邵磊 襄阳市东风汽车公司襄樊医院口腔科 湖北 441004 王智勇 襄阳市东风汽车公司襄樊医院美容科 湖北 441004 !体系要求配制反Ⅱ J重组腺病毒月 g刚同源重组被认为 i，因为未线性化的 @@[1] Parkin DM, Pisan P, Ferlay J. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 1999,49(1):33-64 @@[2] Khan MH, Yasuda M, Higashion F, et al. Nm23-H1 suppresses invasion of oral squamous cell carcinoma-derived cell lines without modifying matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 expression [J].Am J Pathol, 2001,158(5): 1785-1791 @@[3] Willems, Roel, Slegers, et al. Extracellular nucleoside diphosphate kinase NM23/NDPK modulates momal hematopoietic diffentiation [J]. Exp-Hematol, 2002, 30 (7) : 640-648 @@[4] He TC, Zhou S, Da Costs LT, et al. A simple system for generating recombinant adenovirus[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1998,95(5): 2509-2514 @@[5] 戴华生编译.病毒学实验诊断技术[M].江西:江西省科学技术 情报研究所，1979.227-229 @@[6] Br