第一章蛋白质与氨基酸的测定.pptVIP

第十五章 碳水化合物分析 Yangchg@njau.edu.cn 概 述 第一节 水溶性糖的测定 （一） 水溶性糖的提取 热水浸提； 75%乙醇浸提。 澄清与除干扰物（蛋白质、氨基酸、多糖与色素）试剂： 新型无铅沉淀剂 碱式氯化铝溶液：称取50g AlCI3·6H2O，溶于适量的水，加入氨水至不再产生沉淀，真空抽滤，以蒸馏水洗涤沉淀至无Cl-，转人三角瓶，加24.5ml l:1盐酸，加热至溶解，最后调整溶液体积为100mL。 （二） 水溶性单糖（还原糖）的测定 1、铜还的直接滴定法——Lane –Eynon’s method 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 亚甲基蓝指示剂：氧化态为蓝色；还原态为无色。 用标准糖液滴定至无色。 方法要点： 严格按操作要求进行； “约测”与“精测”； 滴定要在有水汽保护下进行，防烫伤； 糖的含量可查表或从标准糖的滴定中求出。 2、高锰酸钾容量法——Munson-Walker’s method 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 可测定Cu2O的量，计算糖的含量。 5× Cu2O + Fe2 (SO4)3+ H2 SO4→CuSO4 + FeSO4 + H2O 10FeSO4+2K2MnO4 +8H2SO4→ 5Fe2 (SO4)3 +2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O 上反应式可知10mol铜相当于2mol高锰酸钾，则每毫升摩尔浓度为1/5 mol/L K2MnO4 溶液相当的Cu量（x)为： 3、半微量法——Shaffer-Somogy’s method 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 用H2 SO4酸化时，Cu2O溶解为Cu+。索姆吉试剂中的和与在酸化同时发生如下反应： KIO2 + KI +3 H2 SO4→K2SO4 + 3I2 + 3H2O 试剂中KIO2的是定量加入的，所以生成的I2也是一定量的。生成的I2与Cu+发生氧化还原反应消耗部分I2 。 2 Cu+ + I2 → 2 Cu2+ +2 I- 溶液中的I2以淀粉为指示剂用Na2S4O6标准溶液滴定。 I2 +2S2O32- → 2S4O6 2- +2 I- 实验同时做空白试验，则 样品应消耗的Na2S2O3毫升数=V空白-V实测 查表或用标准糖测量值比较计算糖含量。 本法适用于含糖量不太高的植物组织样品。 4、氰化盐碘量法——常量法 方法原理 还原糖与已知过量的铁氰化钾碱性溶液作用，生成亚铁氰化钾和糖酸： 糖 + 碱性铁氰化钾 → 糖酸 + 亚铁氰化钾 + H2O 过量的铁氰化钾在HOAc存在下与KI作用，生成游离太的I2 ： 2[Fe(CN)6] 3- + 2 I- →I2 + 2[Fe(CN)6] 4- 加入硫酸锌，使生成的亚铁氰化钾形成白色沉淀亚铁氰化锌，以利反应进行 。 2[Fe(CN)6] 4- + 2Zn2+ → Zn2[Fe(CN)6] ↓(白色） 溶液中的I2以淀粉为指示剂用Na2S4O6标准溶液滴定。 I2 +2S2O32- → 2S4O6 2- +2 I- 实验同时做空白试验，则 样品应消耗的K3 Fe(CN)6 毫升数=V空白-V实测 查表或用标准糖测量值比较计算糖含量。 5、蒽酮比色法——微量法 方法原理 糖在浓硫酸作用下，可经脱水生成糖醛或羟甲基糠醛，可与蒽酮试剂反应生成蓝绿色的糠醛衍生物，用比色法测定（630nm）。 6、3,5-二硝基水杨酸法 方法原理 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以，所得的结果乘以0.9。 7、苯酚比色法——微量法 方法原理 糖在浓硫酸作用下，可经脱水生成糖醛或羟甲基糠醛，可与苯酚试剂反应生成橙红色的化合生生物，10~100mg范围用比色法测定（480nm）。 8、斐林试剂比色法——微量法 方法原理 糖 + 斐林试剂 → 糖酸 + Cu2O↓ + H2O 蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比，可在590nm处比色测定。 9、砷/磷钼酸比色法 方法原理 还原糖是具有羰基（C=O）的糖，能将其它物质还原而其本身被氧化。 (1) 还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，产生砖红色的