菌种的优良选育概要1.ppt

菌种的优良选育 第一节 自然选育 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。 多因素低剂量的诱变效应 互变异构效应 几率：10-8～10-9 自然突变会产生两种结果： 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。 自然选育的方法：单菌落分离法 主要环节 以合适的诱变剂处理 用合适的方法淘汰负效应变异株 一、诱变育种的原理 能诱发基因突变，并使突变率提高到超过自然突变水平的物理、化学因子、生物物质统称为诱变剂。 化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂、氮芥、亚硝酸等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂，如亚硝基胍（NTG)，可诱变得12％～80％的营养缺陷型株，有超诱变剂之称。 使用化学诱变剂的优缺点： 优点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 缺点： 大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。 二、诱变育种的基本方法 (一)出发菌株的选择与纯化 工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。 1、出发菌株的选择 ①以单倍体纯种为出发菌株； ②采用具有优良性状的菌株；如有一定目标产物的生产能力、生长繁殖快、营养要求低等 ③选择对诱变剂敏感的菌株；变异幅度大。 ④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。 2、出发菌株的纯化 原因： 因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。 方法：划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。 （2）菌悬液制备方法 细菌：在诱变处理前进行摇瓶振荡培养，利用温度和碳源控制其同步生长，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在有玻璃珠的三角瓶内振荡10min，用无菌脱脂棉或滤纸过滤，通过菌体计数，调整菌悬液的浓度。 孢子：在试验中尽量采用成熟的孢子，并置于液体培养基中振荡培养到孢子刚萌发，即芽长相当孢子直径0.5－1倍。离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液，振荡打碎孢子团块，以脱脂棉过滤，计数，调整菌体浓度供诱变处理。 对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。 例如：过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为90—99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。 化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间和处理条件（温度、pH等）。 物理诱变剂主要控制照射距离、时间和照射过程中的条件（氧、水等），以达到最佳的诱变效果。 3、诱变方法 （1）紫外线照射 将10mL菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。 实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。 （2）CO60 照射 CO60属γ射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。 （3）等离子输入 较新的诱变方法，变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。 (四)中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 条件抗性突变株的筛选 又称条件致死突变。如温度敏感突变株。 切断和改变平行代谢途径： 由图1