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（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法） 5．结果判定： 淋巴细胞的增殖能力=加ConA孔的光密度值–不加ConA孔的光密度值 受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。 （一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法） 6. 数据处理 一般用方差分析，先检验方差齐性，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性； F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换；若变量转换仍达不到要求，改用秩和检验进行统计。 （二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法） 1．原理 二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其稀释液涂抹小鼠腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4 d～7d 后再将其涂抹于耳部，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24h～48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。 （二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法） 2.材料 DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器 3.试剂配制 DNFB溶液：应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配制好的5ml丙酮麻油溶液（v/v=1:1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250μl注射器通过瓶盖取用。 （二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法） 4.技术要点 （1）致敏 小鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约 3cm×3cm，用 DNFB 溶液50μl均匀涂抹致敏。 （2）迟发性变态反应的产生与测定 5天后，用 DNFB 溶液 10μl 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。 攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。 用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。 （二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法） 5.结果判定 用左右耳重量之差表示迟发型变态反应的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。 6.注意事项 操作时避免DNFB与皮肤接触。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） 1．原理 用绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体可反映抗体分泌细胞数。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） 2.仪器和材料 二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清）、Hanks液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） 3.技术要点 （1）SRBC绵羊红细胞的制备 绵羊颈静脉取血。 将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝 一个方向摇动，以脱纤维。 放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） （2）制备补体 采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清）。 将1ml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中。 4℃冰箱放置30min，经常振荡。 离心取上清，分装，－70℃保存。 用时以SA缓冲液按1∶8～15稀释。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） （3）玻片涂膜 在清洁玻片上刷上一薄层琼脂（0.5%），干后可长期保存备用。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） （4）免疫动物 取脱纤维羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞。 每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×107～2×108个。 也可将压积SRBC 用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） （5）脾细胞悬液制备 将SRBC免疫4～5d后的小鼠颈椎脱臼处死。 取出脾脏，放在盛有Hank‘s液的小平皿内，用4层纱布将脾磨碎，制成细胞悬液，离心10min （1000r/min），用Hank’s液洗2遍。 最后将细胞悬浮在5ml RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/ml。 （三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法） （6）空斑的测定 将表层培养基（1%琼脂糖）加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank‘s液混合，分装小试管，每管0.5ml。 再向管内加50μl 10% SRBC(v/v，用SA液配制)，20μl脾细胞悬液（5×106个/ml），迅速混匀，倾倒于已刷琼脂