应用等位基因特异性PCR 检测NPPB 基因突变.docVIP

精品论文 参考文献 应用等位基因特异性PCR 检测NPPB 基因突变 1.贵阳中医学院 贵州贵阳 550000； 　　2.海南医学院生物化学教研室 海南海口 571199； 　　3.海南医学院附属医院 海南海口 570102； 　　4.海南省中医院 海南海口 570000 　　【摘 要】目的：建立NPPB基因RS3753581突变位点的等位基因特异性PCR技术。方法：应用针对NPPB基因RS3753581突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南黎族人群中NPPB基因RS3753581突变位点类型进行了基因分型检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测分型的样本进行序列测定。结果：在海南黎族人群中,RS3753581突变位点可检测出NN、NM、MM3种基因型,用等位基因特异性PCR技术鉴定的NPPB基因RS3753581突变位点基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论：等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好,可作为鉴定NPPB基因RS3753581突变位点的可行方法。 　　【关键词】NPPB基因；等位基因特异性PCR；基因分型 　　【中图分类号】R746.4 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）6-0151-02 　　笔者应用简便、快速的PCR技术检测NPPB基因RS3753581突变的等位基因特异性,讨论探索海南黎族人群中NPPB基因RS3753581位点的多态性,结果报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 DNA样品 　　从海南省陵水黎族自治县医院随机采集海南籍黎族正常人群且血缘上无关个体的血液样本219份，用EDTA抗凝、SDS方法提取DNA。 　　1.2 等位基因特异性PCR扩增NPPB基因 　　1.2.1 引物设计与合成 从NCBI中获得人类NPPB基因的两个突变位点上下游500bp的基因序列，用PRIMER5.0软件辅助设计引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Rs3753581位点引物设计（Grarr;T），3581-1（上游通用引物）：5prime;-GGGTGGTCAGATGAAGGA-3prime;（Tm值：52.4℃），3581-N（下游正常引物）：5rsquo;-AGCCTGGTTGACAGACAGC-3rsquo;（ Tm值：57℃），3581-M（下游突变引物）：5rsquo;-AGCCTGGTTGACAGAGTGA-3rsquo;（ Tm值：58℃），引物片断长度均为165bp。测序产物扩增引物序列，Rs3753581位点引物，3581-1上游引物设计（Grarr;T）：5prime;-gggTggTCAgATgAAggA-3prime;（Tm值：52.4℃），3581-2（下游引物），5prime;-ggTCCAgTgATgACgAAgT-3prime;（Tm值：51.9℃），片段长度为512bp。 　　1.2.2　PCR扩增　每个多态位点均设立2个PCR检测管,分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个多态位点正常和突变的等位基因。反应体系如下：每管在1times;PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3， 50 mmol/L KCl，1.5~2.0 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2mu;g,引物各0.2~0.5mu;mol/L，, 4种dNTP各200mu;mol/L， Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)1 U。PCR循环参数为：首先在94℃进行5 min的热变性，随后进行38个循环反应(每个循环包括94℃50 s,60℃50 s,72℃10min)。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在UVI band凝胶成像系统(英国UVI tec公司产品)中观察结果并照相。 　　1.3　NPPB基因PCR扩增结果的DNA序列测定 　　随机抽取经上述建立的等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种NPPB基因型的DNA样本，将3581-1和3581-2-2引物对的PCR扩增特异DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。 　　2 结果 　　2.1 NPPB基因Rs3753581突变位点的基因分型结果 　　每种NPPB基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。应用建立的等位基因特异性PCR技术对219例海南黎族人样本DNA进行了NPPB基因的检测。在黎族人群中，RS3753581突变位点可检测出NN、MMM、MM 3种基因型。 　　2.2 NPPB基因PCR扩增结果的DNA测序验证测序结果表明等位基因特异性PCR技术对NPPB基因的分型结果与DNA测序结果相符,