膀胱组织工程种子细胞的分离、培养研究.pdfVIP

吉林省第四届科学技术学术年会 1133 膀胱组织工程种子细胞的分离、培养 石 毅 王 毅 马 杰 田 奇 周余来 (吉林大学药学院长春 130021) 摘 要：目的：对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养。探索用于泌尿系统组织工程的膀胱移行 上皮种子细胞的最佳培养方法。方法：采用中性蛋白酶分离膀胱移行上皮组织、胰蛋白酶消化获得膀胱移 行上皮细胞，将获取的膀胱移行上皮细胞分别接种到含1％、5％、10％和15％血清的DMEM／F12培养液中 进行培养。结果：膀胱上皮细胞在含5％血清的培养液中生长状态最佳。原代移行上皮细胞培养6～7d时可 达80％融合，呈典型的铺路石状，传代培养的细胞生长期稳定且快速，5～6d既可达80％融合。结论：得到一 种稳定、快速的膀胱移行上皮细胞的培养方法。 关键词：膀胱 移行上皮细胞 培养 组织工程学是上个世纪后期快速发展起来的新领域，它是综合应用细胞生物学、生命科学、工程学的 基本原理和方法，通过少量组织细胞经体外培养扩增达到一定数量后，接种到具有一定空间结构的支架 上，构成有生命活力的新型材料，移植到体内以达到修复组织损伤的目的【11。快速、大量获得膀胱移行上皮 细胞，是泌尿系统组织工程发展的首要问题∞】。本研究采用组织工程技术，寻求一种快速，大量获得膀胱 移行上皮细胞的方法。 1材料和方法 1．1 材料 (1)主要试剂：新生牛血清、DMEM培养基、Ham 蛋白酶、噻唑蓝(MTr)。 用LD一2A型离心机、酶联免疫检测仪ELX800。 验中心提供。 (4)培养用液：DMEM：F12=3：l(w／w)含有一定浓度的新生牛血清、EGF和腺甘酸。 1．2方法 (1)膀胱移行上皮细胞的分离及原代培养：取1月龄新西兰大耳白兔，耳缘静脉行空气栓塞处死，无 菌条件下取膀胱，D—Hanks液反复冲洗，剪除脂肪及血管，将膀胱翻转，使其内膜面向外，并将其开口处结 扎，浸泡于2．5％的Dispase中，4。C过夜。分离消化好的膀胱，得到膀胱移行上皮层，剪碎。移行上皮组织放 入0．25％胰酶和0．02％EDTA等体积混合的消化液中37℃消化。倒置相差显微镜下观察组织消化程度。当 组织块分散为单个细胞时；即用5％血清培养液终止消化。用200目的筛网过滤，除去未被消化的组织块。 液。计数，台盼蓝染色检测活细胞数量，以2x105／ml的细胞密度种植于一次性塑料培养板中，置于5％ CO：，37℃饱和湿度孵育箱里培养．首次3d更换培养液，之后隔天换液。 (2)传代培养：倒置显微镜下观察，当细胞达到70％～80％融合时即进行传代。吸弃原有的培养液，用 1134 增强自主创新能力促进吉林经济发展 观察，当细胞间隙变大，细胞变圆，即用5％血清培养液终止消化，吸管轻轻吹打使细胞单个均匀分布。 中培养。置于5％C0：，37。C饱和湿度孵育箱里培养。首次2d更换培养液，此后隔天换液。 (3)细胞形态学观察：每El在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况，拍照记录。 (4)不同浓度血清对移行上皮细胞增殖影响的检测：分别在第1、3、5、7、9d以MTr法作细胞生长曲线 (每组取3个平行样本的平均值)。 2 结果 2．1 原代细胞形态学观察 细胞在接种48h后于倒置相差显微镜下进行观察，少量细胞悬浮在培养液表面，大部分细胞贴壁生 长，贴壁细胞中有少量伸展成不规则多边形，之后贴壁生长，细胞数量逐渐增加，可见形成细胞集落。5d 后，细胞集落进一步扩大连接成片，表现为典型的铺路石状，6～7d细胞即可融合到70％～80％，可以传代。 2．2传代细胞形态学观察 传代后细胞较原代细胞贴壁所需时间短，接种后36h左右即可贴壁，贴壁后细胞扁平变大，呈多边 形，高倍显微镜下细胞核清晰可见，并可见核分裂相。接种3d后细胞加速增殖，5～6d可达到70％以上融 合，可以再行传代。传代培养的细胞形态更加均一，细胞生长状态良好，且保持稳定生长的特点。传代细胞 2d即可形成细胞集落，伸展为不规则多边形，5d可观察到成片细胞，形态为典型的铺路石状。传代后细胞 5—6d即可融合。 2．3 不同浓度血清对移行上皮细胞增殖的影响 见表1。 表1 不同浓度血清对移行上皮细胞增殖的影响 培养时间