Pax5启动子的克隆及其在人淋巴瘤细胞系HL-60中转录因子的确定.pdfVIP

第 12卷第 2期 潍坊学院学报 Vo1．12No．2 2012年 4月 JournalofWeifangUniversity Apr．2012 Pax5启动子的克隆及其在人淋巴瘤细胞系 HL一6O中转录因子的确定 孙藜玮，郭永卫 (烟台职业学院，山东 烟台 264670) 摘 要：克隆Pax5基因的启动子，插入荧光素酶报告基因载体中，并检测其活性；采用PCR技术从人 淋巴瘤细胞系HL一60基因组中扩增出Pax5启动子，插入荧光素酶报告基因载体 pGL3一basic中，确定 所扩增的DNA序列，在 293T细胞中检测其活性；测序结果表明扩增的Pax5启动子序列正确，活性实验 表 明构建的报告基因具有启动子活性，转录因子 SP1和 Runxl能以剂量依赖的方式提高Pax5报告基因 的转录活性；克隆了Pax5启动子，并发现转录因子 SP1和 Runxl能够调控 Pax5的转录。 关键词：Pax5启动子；荧光素酶报告基因；转录活性 中图分类号：Q503 文献标识码 ：A 文章编号：1671--4288(2012)02--0059--03 Pax5(pairedbox)基因家族是一种重要的转录调控因子，其在胚胎发育过程中，神经及B淋巴细胞的 发育分化中都起到关键的作用 ，同时在 B细胞早期定性分化、晚期成熟增殖、同型转换、免疫球蛋白基 因转录及终末分化中也起着重要作用[3--43。随着研究的深入，人们发现在部分急性淋巴细胞 白血病中 Pax5基因蛋 白异常表达 引，这意味着其可能在 白血病中起到一定的作用。为了进一步研究白血病中共调 节子的功能，从人HI--60细胞基因组中克隆得到Pax5基因的启动子序列，并构建了由Pax5启动子调控 的荧光素酶报告基因质粒，根据共调节子对 Pax5报告基因活性的影响，可以更好地了解其在白血病中发 挥的作用，为寻找治疗 白血病奠定基础 。 1 材料与方法 1．1 材料 ● 293T(人胚胎肾细胞)由本实验室保存。荧光素酶报告质粒pGL3一basic购 自Promega公司；大肠杆 菌DH5a、含有人全长SP1编码序列的质粒由本实验室保存。 构建载体所用限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶购 自TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒购 自博 迈德公司；DMEM细胞培养基、转染试剂LipofectAMINE2000购 自Invitrogen公司。 1．2 人淋 巴瘤细胞系HI一60基因组DNA的提取 按照Tiangen(天根)公司的说明书进行，详细步骤同说明书，试剂盒货号为：DP304。 1．3 Pax5启动子序列的扩增 根据GenBank中报告的序列设计引物。其PCR扩增的上游引物和下游引物分别是：5--CTCGAG～ GTGATGTTGGCGAGAACAGGA一3和 5一 AAGCTTCTGGGGTAGCTGATCACTG一 3。限制性 内切酶XhoI和HindlII为上下游引物携带的酶切位点。PCR模板为人淋巴瘤 白血病细胞系基因组 HL 一 60DNA。PCR程序设计为，94℃变性 3分钟，60℃复性30秒、72℃延伸 2分钟，25个循环。 1．4 重组质粒的构建、鉴定与测序 用 XhoI和HindIII酶切纯化后的PCR产物，然后连接到经同样酶酶切过的pGL3一basic载体中，转 化到感受态细胞 DH5a中，然后提取质粒，鉴定阳性克隆并测序。 1．5 细胞转染 * 收稿 日期 ：2011—1】一24 作者简介：孙藜玮(1981一)，女，山东招远人，烟台职业学院助教。 一 59 — 潍坊学院学报 2012年 4月 1．5．1 不同剂量SP1对Pax5报告基因荧光素酶活性的影响