Pax6 variant新基因的原核表达蛋白纯化和多克隆抗体制备.pdfVIP

济宁医学院学报 201i年 12月第 34卷第 6期 381 doi：10．3969／j．issn．1O00—9760．2011．06．001 ·基础医学 · Pax6variant新基因的原核表达 蛋白纯化和多克隆抗体制备 李 杰 高 岚。 宋德潇。 (济宁医学院精神卫生学院，山东 济宁 272067；兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州 730000；。兰州大学第一人 民医院，兰州 730000) 摘 要 目的 构建花背蟾蜍 (BuforaddeiStrauch)转录因子Pax6variant的原核表达载体 ，纯化融合蛋 白 His—Pax6variant并以其为抗原免疫家兔，制备花背蟾蜍转录因子Pax6variant多克隆抗体。方法 RT—PCR扩 增得到花背蟾蜍胚胎组织的Pax6variant基因，并将此片段与原核表达载体 pET一28a—C连接，构建重组表达质粒 pET—Pax6variant并转化大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株 ，诱导融合蛋 白His—Pax6variant表达；所获得 的可溶性蛋 白经亲和层析纯化、SDS电泳鉴定后，免疫家兔制备抗血清，分别采用 ELISA、Westernblot检测抗体效 价和特异性 结果 从花背蟾蜍胚胎组织中克隆了Pax6variant基因，并成功构建 了其原核表达质粒；SDS- PAGE结果证实获得Mr为43300的His—Pax6融合蛋 白且为可溶性蛋 白；经过His亲和层析有效纯化；以该融 合蛋 白免疫家兔制备得到的抗血清经 Westernblot检测证实能与 目的蛋 白发生特异性结合，ELISA 检测为阳 性。结论 获得了花背蟾蜍转录因子Pax6variant蛋 白及特异性多克隆抗体，对进一步研究花背蟾蜍Pax6va— riant在发育过程 中功能奠定基础 。 关键词 花背蟾蜍 ；Pax6variant；原核表达 ；多克隆抗体 中图分类号：Q954．4 文献标志码：A 文章编号：1000—9760(2011)12—381—05 Prokaryoticexpression，affinityproteinpurificationandpolyclonal antibodypreparationofaNovelGenePax6variant LIJie．GA0Lan，S0NGDe—xiao (Schoolofmenta1health，JiningMedicalUniversity，Jining272067，China) Abstract：Objective ToconstructtheprokaryoticplasmidexpressingthetranscriptionfactorPax6variantof BuforaddeiStrauch，purifyHis·Pax6variantfusionproteinproducedbytheexpressionsystem ，andprepareitsan— tiserum．Methods ThetranscriptionfactorPax6variantwasamplifiedbyRT—PCR from theembryoofBuforaddei StrauchandclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET-28a—C，andthenexpressedinE．coliRosetta(DE3)in whichHis·Pax6fusionproteinwasinducedbyIPTG．AfterthesolubleproteinwaspurifiedbyHisaffinitychroma- tographyandidentifiedbySDS，therabbitswereimmunizedwiththefusionproteinandtheantiserum was