耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建及酶学性质的研讨.pdfVIP

耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建及酶学性质的研究 1,2 ∗2 1 1,2 1 熊莲 ，罗晖 ，常雁红 ，刘灵芝 ，周北海 （1 北京科技大学环境工程系，北京 100083；2 北京科技大学生物科学与技术系，北京 100083 ） 摘 要：对堆肥和土壤样品进行热选择性培养，通过巢式PCR 从混合微生物样品的基因组DNA 中获得嗜热脂肪芽孢 杆菌过氧化氢酶基因(CAT) 。将该基因克隆到表达载体pET-28a(+)上，并转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3) ，从而构建 得到重组菌E. coli BL21(DE3)/pET)-CAT 。SDS检测显示83KD 处有明显的条带，结合酶活分析确定CAT 在重 组大肠杆菌中得到高效表达。重组菌破碎得到的粗酶液进行金属亲和纯化后，比酶活为484.56 U/mg 蛋白。对纯化酶 进行酶学性质研究发现，该酶的最适催化温度为60℃-70℃，30℃-70℃时热稳定性良好；pH6.0 时酶活最高，在pH5.0-9.0 范围内酶稳定性好；催化底物(H O ) 最适浓度为50mmol/L，K 值为22.62mmol/L 。 2 2 m 关键词：耐热过氧化氢酶，嗜热脂肪芽孢杆菌，巢式PCR ，酶学性质 引言 过氧化氢酶(Catalase, CAT, EC .)属氧化还原酶类，它能分解过氧化氢生成水和分子氧，因 此具有清除超氧自由基、H [1] O 、过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成的功能 。它广泛存在于 2 2 好氧微生物和动、植物体内，是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，在食品、 环保、纸浆和造纸业、以及纺织行业具有重要的工业应用价值[2] 。 传统商品过氧化氢酶来源于牛肝和中温微生物，热稳定性较差，在较高温度下易失活，而纺织、 印染、造纸等行业的许多新工艺要求过氧化氢酶具有较好的耐热性。从1986 年开始，国内外开始进 行热稳定性的过氧化氢酶的筛选工作，已经发现了几种嗜热菌产生的过氧化氢酶[3-6] ，但目前国内的 耐热过氧化氢酶主要依赖进口。1989 年 Suvit Loprasert 等人提取了嗜热脂肪芽孢杆菌产生的过氧化 氢酶基因序列per A[7] [8] ，其过氧化氢酶热稳定性很好 。与野生菌相比，重组大肠杆菌具有培养条件简 单和外源蛋白高效表达等优点。因此本文采用微生物选择性培养结合分子生物学的方法[9]从高温环境 中快速获得该嗜热过氧化氢酶基因，构建高效表达的基因工程菌并研究重组过氧化氢酶的酶学性质。 1.材料与方法 1.1 质粒和菌株 克隆质粒pGM-T 购自TIANGEN 公司，表达质粒pET-28a(+)来自本实验室保藏，大肠杆菌TOP10 用于质粒克隆，大肠杆菌BL21(DE3)作为基因表达的宿主菌。 1.2 工具酶和试剂 各种限制性内切酶和T4 DNA Ligase 购自TaKaRa 公司(大连）；Taq Plus DNA 聚合酶、Pfu DNA 聚合酶购自TIANGEN 公司；基因组DNA 提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA 回收试剂盒购自北 京博大泰克试剂有限公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母粉(Yeast extract)为OXOID 公司产品；其它试剂为 国产分析纯。 1.3 嗜热微生物的培养及基因组DNA 的提取 分别将土壤和堆肥样品经无菌水稀释、振荡摇匀(45℃，200 rpm、20 min)后，涂布平板，55℃过 夜培养，用无菌水混匀平板上的菌落，取混合菌液接种于液体LB 培养基55℃、200rpm 摇床培养12h， ∗联系人：罗晖，男，博士，副教授，E-mail: lhluohui@，010 以选择性培养嗜热微生物。参照基因组DNA 提取试剂盒的说明书提取基因组DNA 。 1.4 引物设计 根据NCBI 数据库中Suvit Loprasert 等人发表的嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因序列(perA， 2208bp)设计两对引物，第一对引物不引入酶切位点