鸡β2微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化.pdfVIP

Keawcharoen K，eta1．PoovorawanYAvianinfluenzaH5Nlin and 【61 J，Oravecrakul tigersleopard§．Emerg IflfectDis．2004；10(12)：2189·9l 阴田欣田．现代动物病理学实验技术【M】．第l版，北京：农业大学出版社，1992 xiuHua a1．AMouse f81 L‰TerrencrM．Tmumpey,TimothYMorken,et and to ModelfortheEvaluation ImmunityHsNlInfluenzaAⅥru∞s饵5N1)Isolatedfrom ofPathogenesis Humans f91NishimuraH，ItamuraS，1wasakiT，eta1．JoumalofGeneral t10)：2503～2510 Virology．2000，81(I Kuiken G，AvianH5Nlinfluenzsin 【101 T，Rimmelzwaan catsm．Science．2004；306(5694){241 鸡p2微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化 刘光亮o2、童铁钢02、孟庆文o 2、吴东来H (1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨，150001； 2．中国农业科学院研究生院，北京100081) 摘要 2微球蛋白(2--m)是组成MHCI类分子复合体的轻链分子，对于MHCI类分子在细 胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。本试验从来航鸡全血细胞中克隆了鸡2m全基 因，利用软件预测了其信号肽序列，并构建了表达成熟2m的重组载体，且在大肠杆菌表达 系统中以包涵体形式高效表达。将所得包涵体溶于8M脲，并在变性条件下对包涵体中的重组 鸡2m进行了纯化，获得了高纯度的鸡2m，为制备MHC I四聚体及探索禽麴碰CI类分子结 构与功能关系提供了条件。 关键词 微球蛋白基因克隆高效表达纯化 主要组织相容性复合体(姗C)I类分子四聚体技术自1996年Altman等n1首次报道以来， 已成为研究特异性CD8+T细胞免疫特性的重要技术u曲1，已在包括SARS-CoVHl在内的病毒性疾 病、自身免疫性疾病悔3以及肿瘤喁1等基础和临床研究领域中得到广泛应用。埘CI类分子由 一条45ku的重链(链)和12ku的轻链(链)经非共价键结合而成，其中重链由多个基因位点 和多种等位基因所编码，共显性表达，呈高度多态性：而轻链则为高度保守的2一微球蛋白 (2-microglobulin，2m)u。。因此，大量纯化的2m是制备抗原特异性姐C四聚体的必 备条件之一n。 目前，入MHC(即人白细胞抗原，HLA)、鼠MHC(最PH-2)以及猿猴MRCI类分子四聚体 技术都已得到广泛深入的研究。然而迄今为止，还未见到鸡的MHC I类分子(B—F)四聚体技 术的成功例子，也没见到表达鸡 m的相关报道。 为此，我们从纯系SPF来航鸡外周血细胞中克隆了鸡2m基因，采用相关软件预测了鸡 2m基因的信号肽序列，将表达成熟的鸡2m基因克隆至原核表达载体，在大肠杆菌(E coli)中获得了高效表达，所表达蛋白以包涵体形式存在，将其超声波破碎离心后沉淀溶 于8M脲，建立简便有效的2m包涵体复性方法后对表达产物进行了纯化和鉴定，为下一步以 基因工程方法制备B-F四聚体奠定了基础，也为研究B—F的结构与功能关系做好了物质储备。 1 材料和方法 1．1 材料 纯系SPF级来航鸡抗凝血由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心提供：大肠 X 肝