植物组织培养 第十章 原生质体培养.docxVIP

第十章原生质体培养教学目的与要求：深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。第一节、原生质体研究概况一、原生质体的概念原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。二、原生质体研究进展据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。三、原生质体研究的意义1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。第二节、原生质体的制备1、用于分离原生质体的材料准备无菌试管苗叶片上胚轴和子叶培养细胞2、酶处理原生质体分离常用的商品酶纤维素酶类果胶酶类半纤维素酶酶溶剂及其渗透压酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶浓度及酶解时间酶解时间酶浓度酶解温度3、原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(20mosm／kg H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。FicollFicoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。以火炬松胚性细胞悬浮培养系为试材，原生质体纯化采用漂浮法，上层为6%的Ficoll溶液，下层为9%的Ficoll溶液，1000 r/min离心5 min后，原生质体悬浮于上层。普通马铃薯四倍体栽培种甘农薯2号、Favorita、Russet Burbank试管苗叶片为材料来源,游离培养马铃薯原生质体.结果表明,游离前材料的低温预处理,酶解前对组织和酶液进行真空渗透处理,均能显著提高原生质体产量.用Ficoll密度梯度离心法收集原生质体进行培养,结果表明第三、四层界面的原生质体有较好的培养效果.沉淀法常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。4、原生质体活力检测目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。5、影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响第三节、原生质体培养一、培养基1．渗透压常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。2．无机盐大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度3．有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4．激素常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D5．pH值四、原生质体培养方法液体浅层培养固体培养液体－固体双层培养琼脂糖珠培养用适温的琼脂糖液与提纯的原生质体液混合均匀，然后以0.5ml左右的液滴滴入培养液中，待形成琼脂糖珠后，震荡培养的一种方法。五、愈伤组织形成和植株再生细胞分裂与细胞壁再生愈伤组织形成愈伤组织分化植株再生第四节、影响原生质体培养的主要因素一、基因型较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。Dudits等（1991）用苜蓿(Medicago sativa)不同基因型做了较深入的研究，认为有某个基因型在离体培养时难以形成细胞胚。二、原生质体的来源供体材料体类型供体细胞的分化程度供体细胞的生长同步性三、起始培养密度与培养基基本起始密度培养基激素水平密度与培