重组人角化细胞生长因子2KGF2聚乙二醇定点化学修饰.pdfVIP

3真核袁赵瀚的工艺特点 ．真核基因工程表达产物，一般是以分泌形式表达，培养液中目标蛋白产量低(如 需要去除的杂质多为培养基、血清蛋白(生长培养)、牛血清白蛋白(收获期培养)、细 胞代谢产物、死亡细胞、细胞碎片及碎裂后的少量细胞内容物等。另外，据报道70％ 的蛋白因子可在毕赤酵母细胞中进行成功的表达，其水平可达lg／L，有的可高达 lOg／L，特别是以小分子有机物(如葡萄糖、甘油或乙醇)为生长期碳源，以甲醇为诱 导且为唯一表达期碳源时，由于培养上清目标蛋白含量高， 培养基的理化性质与目 标蛋白差异大，纯化工艺更简单。 由于真核表达产物多为糖蛋白，为了不损伤目标蛋白的完整性，保持其生物活性， 因此工艺过程中必须保证其糖基不脱落。 作者简介：董晓杰，军事医学科学院生物工程产品中试生产基地主任，副教授，医药生物技术 专业，电子邮箱：dongjiaojie66@yahoo．corn．cn 重组人角化细胞生长因子2(KGF一2)聚乙二醇声步化学修饰枣 黄志锋12王珊珊3李校垄1234冯文科2吴晓萍4 于平野2 张林波3 0094) (1南京理工大学化学工程学院南京21 (2温州医学院生物与天然药物研究院温州325035) (3吉林农业大学生物制药实验室长春130118) (4暨南大学基因工程药物国家工程研究中心广州510630) 角化细胞生长因子-2(keratinocytegrowthfactor一2，KGF一2)系成纤维细胞 生长因子家族的重要成员，它是来源于胚胎上皮细胞的一种碱性蛋白，由208个氨基 酸残基组成，主要在间充质细胞合成，通过与上皮细胞细胞膜上的受体作用，特异性 促进上皮细胞的增殖、分化和迁移。KGF-2在新生或成年间质成纤维细胞系、成年人 的肾、胃肠道脏器等均有表达。KGF-2的作用主要表现为抗肝肺组织纤维化、促进创 伤性组织损伤、慢性组织损伤(糖尿病患者的持续性损伤)以及静脉溃疡(包括肠胃 的慢性溃疡)的修复和愈合等，具有广泛的应用前景，但是长期以来KGF一2表达量低 ·国家863专题项H(2007AA02ZI10)和温州市科技攻关重点项目(Y2007A106)资助项目 22 一赢是制约其产业化的关键闻题，此癸，长期的研究及l瞄床实践表明KGF一2与其它蛋 白质药物一样，也存在稳定性差、体内半衰期短的问题。目前本科研团队已经通过构 建KGF-2与SUMO标签融合的基因序列，戒功获得了表达率达20％以上的高效工程菌株 及纯度高达94％以上的重组蛋白，但是如何有效的改善KGF一2稳定性差的缺陷成为另 一个重要的课题。为了获褥稳定性好的KGF-2，我们通过聚乙二醇定点化学修饰技术 活性及稳定性。 本实验主要考察反应物质量比、反应温度和反应时间这三个因素对修饰结果的 oC、8 于4 0C、25℃下进行反应，反应时间分别取5h、lOh、15h，从而采用三因素 G-25柱除盐，将收 拼，结果鼹示，修饰率超过30％。将反应液过平衡好的Sephadex 集到的含有所需物质的洗脱峰过肝素亲和层析柱进行分离纯化，即将洗脱峰上已经用 SepharoseTMCL一6B柱，采用梯度 20mmol／L、pH6．20的醋酸钠溶液平衡好的Heparin 洗脱，SDS电泳结果显示，L2mol／LNaCl+20mmol／L醋酸钠溶液的洗脱峰即为 细胞增殖作用，并且在一定的浓度范围内与剂量成正相关。丽对于修饰前后rhKGF一2 稳定性的考察我们则通过在37℃大鼠血清中加入等物质的量的rhKGF一2和PEG_ 活性保存率分别为88．50％和36．25％，实验结果表明前者在大鼠血清中热稳定性明显 高于后者。另外我们还研究了修饰前后rhKGF一2抵抗胰蛋白酶降解能力的变化情况， 扫描法检测得出修饰产物仍然存留37．6％，而未修饰产物基本被完全降解，由此可见， 修饰后的rhKGF-2抗胰蛋白酶水解能力明显增加。 本实验通过聚乙二醇定点化学修饰rhKGF-2，不但筛选出了最佳修饰条件，而且 分离纯化出高纯度的修饰产物，通过对修