DMEM培养基制备SOP.doc

DMEM培养基的配置 实验目的 配制DMEM培养基 实验原理 DMEM培养基的用途 DMEM and Click’s media have an osmolarity that is more compatible with mouse serum than RPMI; in fact, RPMI was specifically designed for the culture of human cells. 本实验室在培养小鼠来源细胞时选用DMEM培养基的理由 培养基中各种组分的作用及添加依据 Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸, 238.3）：25mM?/L?(5.9575g/L)，不加碳酸氢钠时pH为6.7±0.3，加碳酸氢钠时pH为7.0±0.3。单独配制时，配制为100X即0.6g/ml。 配制2.5M?/L?(0.6g/mL) Hepes：12g的Hepes定容到20ml PBS中，过滤除菌，分装为1ml/管，－20°C保存。Cell Biology建议为4°C保存。 HEPES 是一种非离子缓冲液,在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力,但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒.HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加(不懂，何为抵消？邹强).在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中. 来自网络。 缓冲系统: 来自网络。 大多数细胞所需pH 在 7.2 - 7.4.但是,细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4). 由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2体系进行缓冲,因此,气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡.如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5%,培养液中NaHCO3的加入量为1.97g/L;如果CO2浓度维持在10%,培养液中NaHCO3的加入量为3.95g/L. 细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换. 大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色. 碳酸氢钠：CO2浓度为5%时，培养液中碳酸氢钠浓度为1.97g/L；CO2浓度为10%时，培养液中碳酸氢钠浓度为3.95g/L（科学出版社.细胞实验指南P6）。DMEM的说明书上为3.7g，我们实际添加为2时，如果加入25mM Hepes在5%CO2条件下，测定PH为7.11；不加Hepes时PH为7.44。添加碳酸氢钠3.7g在在5%CO2条件下的PH是？？ （引自Cell Biology）：Most cell culture media require an atmosphere of 5% CO2 to maintain pH 7.4. However, certain media contain levels of bicarbonate that require different amounts of CO2. For example, DMEM containing 3700 mg/liter of sodium bicarbonate equilibrates to ～pH 7.6 in a 5% CO2 environment and requires 10% CO2 to maintain pH 7.4. （引自IMMUNOLOGY）：HEPES buffer (10 to 25 mM) must be included in media used in short procedures that are not performed in a defined CO2 atmosphere. HEPES maintains the pH of the media regardless of atmospheric CO2; thus, it is often used as an additive to media used in CO2 incubators since it renders the pH of the media less sensitive to small fluctuations in CO2 concentration. 小苏打又名碳酸氢钠，为白色结晶性粉末，无臭，味微咸，在潮湿空气中即缓慢分解。易溶于水，水溶液呈弱碱性反应，水溶液放置稍久，或振荡，或加热，其碱性即增强(怀疑是生成CO2，从溶液中溢出。邹强)。在乙醇中不溶。 白色晶体，或不透明单斜晶系细微结晶。比重2.159。无臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微碱