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化学发光免疫技术 广州医学院检验系临床免疫教研室 王 慧 有关发光的基本知识 光照发光:荧光 生物发光：荧火虫 化学发光：某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 化学发光剂分类 一、酶促反应的发光剂 由于酶的降解作用而发出光 酶 底物 HRP 氨基苯二酰肼类（鲁米诺及 异鲁米诺衍生物) HPA AP AMPPD ,4-MUP 鲁米诺作为HRP底物的发光原理 4-AMPPD 4-甲氧基-4-9-4-苯磷酸盐 由二氧四节环将苯环和金刚烷联接起来，其断裂可发射光子 分子中存在磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定 4-AMPPD发光原理 有碱性磷酸酶存在时， 4-AMPPD作为酶的底物会在酶的催化下脱去磷酸根基团，形成一个不稳定的中间体AMP-D 这个中间体随即自行分解（二氧四节环断裂），同时发射光子 二、直接化学发剂 不需催化剂(酶)的存在, ,仅改变系统PH等条件即能发光的一类物质 常见的是吖啶酯 三、电化学发光剂 通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质 发光底物：三联吡啶钌[Ru(bpy)32+]， 电子供体：三丙胺（TPA） 化学发光标记物的制备 良好化学发光剂(标记)的条件 能参与化学发光反应 与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂 偶联后仍保留高的量子效应和反应动力 应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性 发光免疫技术分类 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA) 化学发光免疫分析（chemiluminescent immunoassay,CLIA） 电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay,ECLI) 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA) 属于酶免疫测定中的一种技术，以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性。 标记酶：HRP，AP 底物：发光剂（鲁米诺及其衍生物,AMPPD) 检测仪器：化学发光检测仪 技术要点 抗原抗体反应（双抗原、双抗体夹心法，固相抗原竞争法） B、F分离（磁颗粒分离法，微粒子捕获法，包被珠分离法） 酶促发光反应 方法学评价 　　 经酶和发光两级放大，灵敏度高 　　 易引起非特异性吸附和血清中过氧化物酶干扰 化学发光免疫分析（chemiluminescent immunoassay,CLIA) 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。 标记物：常用的标记发光剂-吖啶酯类发光剂 吖啶酯作为标记物的优点：①氧化反应不需催化剂，只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H2O2后再加氢化钠溶液，发光反应迅速，本底低。②可直接标记抗原或抗体，。。。。③试剂稳定性好。?分离剂为固相磁粉。。。。。 技术要点 抗原抗体反应（双抗原、双抗体夹心法，固相抗原竞争法） B、F分离（磁珠法） 化学发光反应（加入PH纠正液，再加入氧化剂，启动化学反应） 电化学发光免疫测定技术（electrochemiluminescence immunoassay,ECLI) 是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的技术，是在电极上由电化学引发的特异性化学发光反应 包括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。 标记物：三联吡啶钌[Ru(bpy)32+] 优势：标记物可再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定 技术要点 1、 抗原抗体反应（双抗原、双抗体夹心法，固相抗原竞争法） 2、 B、F分离（磁珠法） 3、 电化学发光反应（加入含TPA的缓冲液，同时电极加压，启动电化学反应） 反应模式图 检测原理（以TSH检测为例） 第一步：结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ + N羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。 第二步：将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物