克隆文库与系统发育分析.pptVIP

克隆文库构建与系统发育分析;常用分子生物学技术;16S rDNA 克隆文库; 通过研究基因组中的“biomarker”来研究环境中微生物的多样性的 GenBank / RDPⅡ Ribosomal Database Project Ⅱ /html/;1. PCR扩增;粘性末端之间的PCR 产物连接。 载体具有的氨苄青霉素抗性，所使用的宿主菌DH5α 没有该抗性基因，因此只有带有该质粒的克隆才能在含有氨苄青霉素的平板上生成。;感受态细胞中加入连接产物进行转化； 抗生素抗性筛选（转化菌液均匀地涂布于含 Amp、X-gal、IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。）;过PCR 的方法检查插入片度的大小是否正确 载体上插入有16S rDNA 序列的阳性克隆 载体引物;为了减少测序的数量，可以先分别用两种不同的核酸内切酶分别对文库进行分型 Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis Restriction Fragment Length Polymorphism ;测序反应 按序列相似性大于97%（97%-100%都可以）的标准，把所有的测序结果分成若干个OTU（operational taxonomic unit）。然后用每个OTU 的代表序列在GenBank 和RDPⅡ数据库中进行比对，就可以找到这些OTU 相应微生物的系统发育地位，这样就可以知道环境中微生物的组成情况 ;16S rDNA 克隆文库的库容（library size） Rarefaction curve Coverage C Species richness Shannon Index Simpson Index;序列处理软件：Sequnecher BLAST比对 Clustal X BioEdit 建树软件：MEGA/PAUP/PHYLIP ;系统发育学研究的是进化关系；系统发育分析就是要推断或者评估这些进化关系。 序列比对是构建系统发育树、进行系统发育分析的前提和必要条件，目的是建立起所检测序列与其他序列的同源关系, 提取系统发育分析数据集 系统发育树是表达分类群之间系统发育关系的一种树状图, 它可以推测生物类群系统发育的分支样式, 给出分支层次或拓扑图形, 并能估算类群之间遗传关系的远近。在生物进化研究中, 通过构建系统发育树, 可以推断个体之间以及群体间的亲缘关系, 以及研究对象在系统树中所处的进化地位等。 比对 建立取代模型 建立进化树 进化树评估 先进行序列比对；再利用比对的结构用合适的算法求出遗传距离；最后再根据遗传距离构建发???树 通过系统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表（进化树）来描述，这个进化树就描述了同一谱系的进化关系。;距离法（Neighbor joining, NJ） 数据组中所有序列两两对比的结果 在系统发育树构建中应用最为广泛, 它基于最小进化原理, 可以较快的构建系统树, 同时也比较适合于分析较大的数据集, 并可以很快地进行自展检验。 最大简约法（maximum parsimony, MP） 多重比对的结果 当序列分歧度较低时,无需模型,源于形态性状的研究 最大似然（maximum likelihood，ML） 多重比对的结果;Jukes-Cantor 模型假定任一位点的核苷酸替代频率都是相同的 Kim ura 双参数模型考虑了转换和颠换速率的不同 Equal-Input Tamura-Nei etc…..;;;Thanks for your attention!