原代培养及冻存和复苏.pptVIP

细胞的冻存与复苏以及角膜原代细胞的培养;一、细胞的冻存与复苏;1.2 细胞的冻存 1.2.1冷冻保护剂 冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。一般只有红细胞、大多微生物和极少数有核的哺乳动物细胞冻存时可不加冷冻保护剂；但对大多数有核哺乳动物细胞来说，冷冻时必须加冷冻保护剂。 渗透性冷冻保护剂：甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等小分子， 其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞 内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰 溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。 非渗透性冷冻保护剂：，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚 乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等大分子物质。其保护 机制的假说很多，其中有一种是，减少冰晶的形成。;1.2.2冷冻保存温度 ;梯度冷冻: 冻存管置于室温→4℃→-20℃→-70℃→液氮槽长期储存。不同细胞的梯度温度放置时间不同。 程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽长期储存。适用于悬浮型细胞之保存。 ;甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让其渗透到细胞内，细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。 DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在4℃下进行，一般需要40～60分钟。 在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果，一般使用过0.22μm滤膜的DMSO ，而医用甘油可以灭菌，较安全方便。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱或液氮口中，惟存活率稍微降低一些。 ;1.3细胞的复苏;1.3.2 复温速率 复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。 一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。 注意：因为在复苏时，需要从-196 ℃的液氮中取出冻存管，立即投入37～40 ℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险，冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。 ;二、角膜原代培养;2.2细胞培养液及消化液的制备 基础培养基：DMEM和F12按照1:1混合，使用时加20%胎牛血清，硫酸妥布霉素（100U/mL）和EGF、bEFGF适量。 细胞消化液：称取0.25g胰蛋白酶和0.02gEDTANa，溶于100mL D-Hank’s中，充分溶解后，过0.22μm滤膜，配成含 0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTANa的消化液， 4℃保存备用。;2.3 角膜原代培养 无菌条件下摘取一月龄小白兔的眼球，剔除眼球周边的结缔组织，用无菌生理盐水冲洗3遍，尽量将血迹洗干净，在含1.6×106 U/mL的硫酸庆大霉素的无菌生理盐水中浸泡20min灭菌。 将眼球移至无菌培养皿中，D-Hank’s冲洗眼表2~3次，在超净工作台上用灭菌刀片沿角膜缘内侧1mm环形划一圈，再在中间轻轻划一个十字，（注意：不要将角膜划破） 用眼科镊沿划痕处撕下上皮层，立即放入置白瓷板上，加几滴血清浸泡，锐利的眼科剪将其剪成小块，上皮面向下平铺于细胞培养瓶中； ;再沿角膜缘内侧1mm剪下角膜，D-Hank’s轻轻漂洗两次， 手术显微镜下将后弹力层和角膜内皮层部分与基质层撕开，用 D-Hank’s漂洗2次，置白瓷板上， 将后弹力层和角膜内皮层部分加几滴血清浸泡，锐利的眼科剪将其剪成小块，内皮面向下平铺于细胞培养瓶中； 基质部分加胰酶消化2-3min，加血清终止消化，锐利的眼科剪将其剪成小块，凹面向下平铺于细胞培养瓶中， 各组均加少量血清与组织块周围，于37℃，5%CO2细胞培养箱培养2-4h，待组织块贴附牢固之后，加少量细胞培养液， 于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续培养。24h后，补足细胞培养液至3mL，72h后，细胞换液。倒置显微镜下观察。 ;2.4 细胞观察;内皮原代;谢谢大家！