免疫微生物实验课件（汕头大学）第8次实验 沉淀反应.pptVIP

医学免疫学实验 第8次实验 沉淀反应 1. 录像 2. 双向免疫扩散试验（操作），对流免疫电泳 （示教） 3. 抽血3ml（每组一人，下次实验用） 单向免疫扩散single immunodiffusion 抗原的定量技术 Method: Ab- in gel Ag- in well 双向免疫扩散double immunodiffusion 抗原或抗体的定性、组成和两种抗原的相关性分析。 抗原抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，;两者相遇时在比例合适处形成沉淀线。 双向免疫扩散实验 步骤： 1. 琼脂板的制备(5ml) ； 2. 打孔； 3. 加样；（中央孔加抗AFP血清，1、4孔加阳性对照， 2、3、5、6孔加待检） 4. 湿盒扩散；37?C，24h 对流免疫电泳检测血清中AFP 1、3孔加抗AFP抗体 2孔，AFP阳性对照血清 4孔，待检血清 pH 8.6巴比妥缓冲液 第9次实验 免疫标记技术 1.录像（免疫标记技术） 2.ELISA(操作，间接法检测抗-HBs） 直接免疫荧光 direct immunofluorescence(DIF) 荧光素标记抗体直接检测组织表面抗原。 间接免疫荧光, Indirect immunofluorescence, IIF 一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。 酶联免疫吸附试验ELISA(Emzyme-Linked Immunosorbent Assay 酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体 免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地 结合的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗 体或抗原。 1.抗原或抗体吸附到固相载体,加入待测抗体或抗原 2.酶标抗原或抗体与已结合的待测抗体或抗原反应 3.加入酶底物，产生有色物质，颜色的深浅与量呈正比 酶联免疫吸附试验Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) 用酶标记抗原(或抗体)检测抗体(或抗原)。 检测敏感度：ng-pg/ml 固相载体： 聚苯乙烯微量反应板 标记酶 辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶(AP) 酶标仪读OD值 直接法direct ELISA 检测抗原 双抗体夹心法Sandwich ELISA 检测抗原 间接法indirect ELISA 检测抗体 间接ELISA法检测血清抗-HBsAb 步骤 1.加血清及对照 第1孔，空白对照，加洗涤液1滴 第2孔，阴性对照，加阴性对照血清1滴 第3孔，阳性对照，加阳性对照血清1滴 第4孔，待检血清，加待检血清50?l 2.加酶结合物 加入酶结合物1滴（空白孔不加），混匀，37?C 30min 3.洗板 弃去孔内液体，注满洗涤液，静置5sec，甩干，重复3次。 4.显色 每孔加显色液A、B各1滴，混匀，封板，37 ?C 15min 5.观察结果 * 沉淀反应 概念：可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液、组织浸液、微生物蛋白等）与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。 类型： ★单向免疫扩散 ★免疫比浊法 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 Ag Concentration Diameter Ag Ag Ag Ag？ Ab in gel 单向琼脂扩散试验 抗原 抗体 4 1 2 3 5 6 1 2 3 5 6 4 双向琼脂扩散试验 1 2 3 4 + - 对流免疫电泳 免疫标记技术 概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原 用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。 常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检 测技术等。 特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。 ★免疫印迹法 ★斑点金结合试验 ★放射免疫测定法 ★酶免疫测定法（ELISA） ★免疫荧光技术 常用免疫标记技术： Ag Fluorochrome Labeled Ab Tissue Section 常用的荧光素主要有两种 异硫氰酸荧光素(FITC) 藻红蛋百(PE) 罗丹明（RB200) Ag Fluorochrome Labeled Anti-Ig Tissue Section Unlabeled Ab 免疫荧光技术 酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法) 空白 阴性 阳性 待测 洗涤液 1滴 1滴 50ul * * *