2010年版中国药典卫生学检验培训 2010年版《中国药典》微生物检验技术（崔学文）.ppt

左奥硝唑注射液（ 10mL：0.25g/支） 取样量及 样品浓度 每张滤膜样品量 每张滤膜冲洗量 阳性对照菌 （生孢梭菌） 生长情况 每张滤膜通过量 10ml×10支 C：250mg/ml 33ml 800ml － － ＋ 833ml 1000ml － ＋ － 1033ml 10ml×10支 溶解于500ml 0.9％NaCl溶液 C：4mg/ml 200ml 300ml － ＋ － 500ml 400ml ＋ － － 600ml 注射用盐酸克林霉素（ 0.3g/支） 取样量及 样品浓度 每张滤膜样品量 每张滤膜冲洗量 阳性对照菌 (金黄色葡萄球菌)生长情况 每张滤膜通过量 0.3g×15支 每支溶解于5ml 0.9％NaCl溶液 C：60mg/ml 25ml 800ml － － － 825ml 1000ml － － － 1025ml 0.3g×15支 全部溶解于500ml 0.9％NaCl溶液 C：3mg/ml 167ml 400ml － ＋ － 567ml 500ml ＋ － － 667ml 无菌三针单联管 ----溶解稀释供试品 影响无菌检查方法验证结果的环节 冲洗条件主要是冲洗体积对于无菌检查方法的影响，冲洗体积过大滤膜的截留能力会降低，导致无菌检查假阴性结果的出现建议冲洗量控制在1000ml/膜以内 冲洗量的影响性试验 指征菌：粘质沙雷（Serratia?marcescens） 注：又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。革兰氏阴性，周身鞭毛,能运动。无荚膜，无芽胞，在普通琼脂平板上25～30℃培养1～2天出现粘性、中心颗粒状、有恶臭的菌落。约半数菌株能产生红色的灵菌素(prodigiosin)。在室温条件下易促进色素的生成，因本菌小且有色素，常用于检定滤菌器的质量。 操作步骤：1.湿润滤膜2.加入适量指征菌3.用不同冲洗量对滤膜进行冲洗4.平行进行阳性对照5.取膜培养6.计算回收率 冲洗量的影响性试验 冲洗量的影响性试验 冲洗量 持续冲洗CFU及回收率 分次冲洗(100ml/次)CFU及回收率 阳性对照组CFU 400ml 72cfu 82％ 80cfu 91％ 88cfu 600ml 66cfu 75％ 75cfu 85％ 800ml 50cfu 57％ 69cfu 78％ 1000ml 33cfu 38％ 62cfu 71％ 1200ml 20cfu 23％ 35cfu 40％ 影响无菌检查方法验证结果的环节 中和剂的选择与加入选择：对应的理化特性作为选择依据，如β－内酰胺酶、 MnSO4 ；应对微生物的生长无影响。加入：不同中和剂加入方式效果不一样。通过我们的经验，基本倾向于直接加入培养体系中。 影响无菌检查方法验证结果的环节 敏感菌株的选择与加入选择：根据抗菌谱和预试验（体外抑菌试验）加入：按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。 影响无菌检查方法验证结果的环节 标准化操作供试液制备：通过比较发现，在检验条件下，0.9%氯化钠溶液对大多数的抗生素粉针比0.1％蛋白胨溶液溶解能力强、溶解速度快。 冲洗方法：少量多次、充分震摇、冲洗体积的控制中和剂和阳性对照菌的加入方式 样品量以及供试液浓度的确定 出厂检验量远远高于上市抽验量，样品量的增加是否会直接导致冲洗量的增加？ 冲洗只能让样品的吸附量降至最低值，即降至基础吸附量 敏感菌的生长取决于培养体系中残留的滤膜基础吸附量 滤膜基础吸附量的多少取决于滤膜材质，和冲洗量无关 样品量与基础吸附量无关 样品量以及供试液浓度的确定 个论化描述时规定供试液浓度，不同取样量参考规定浓度配制，所配供试液浓度不应高于规定值。 微生物限度检查方法验证的思路 选择敏感菌株 选择方法：同无菌验证 选择参考： 一般中药选择枯草和金葡； 一般抗生素根据抗菌谱选择。 原则:由易到难，由简到繁 例：黄芩苷 黄芩苷： 理学性质：几乎不溶于水 查阅文献： 周智兴 傅颖媛 ?《黄芩苷对白色念珠菌细胞周期的影响》 结论 ： 黄芩苷具有明显的抗白色念珠菌作用;黄芩苷能抑制白色念珠菌增殖 验证试验： 1：10供试液混悬，1ml影响菌落识别； 0.2ml/皿，0.1ml /皿，白念回收率明显低于70%； 1：50供试液，澄清，薄膜过滤，300ml/膜； 选择敏感菌株