猪繁殖与呼吸综合征病毒山东株ORF3及ORF5基因的克隆及其真核表达载体的构建研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 猪繁殖与呼吸综合征病毒山东株ORF3及ORF5基因的克隆 及其真核表达载体的构建 王金宝，李俊，张祯涛 (莱阳农学院山东省预防兽医学重点学科，莱阳，265200) DNA疫苗是近几年发展起来的新型疫苗，它是指含有编码抗原基因的真核表达质粒，经直接接种 动物体内后，可被体细胞摄取并表达出相应抗原，从而激发机体产生保护性免疫。DNA疫苗的一个突 出特点是它能通过不同的途径诱导机体产生CD8+细胞毒性T细胞，给机体提供有效的细胞免疫保护。 在预防以细胞免疫反应为主的病毒病时，DNA疫苗显示出传统灭活疫苗所不具有的优势。 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪体后，机体可产生高水平的抗体，但不能有效保护机体， 乳动物表达载体，构建了2个表达载体及1个双表达载体，并在COS细胞上进行了瞬间表达检测，为 探讨ORF3和ORF5表达产物在抵抗PRRSV感染中的作用奠定基础。 1、材料与方法 1．I毒株：猪繁殖与呼吸综合征病毒山东株(暂定名PRRSV—SV一01)由我室分离并保存。 7M TECHNOLOGIES。 Reagent购自LIFE 绿猴肾细胞，为本室保存，培养条件为含10％小牛血清、1％青链霉素、1％谷氨酰胺的1640培养液。 小牛血清购自天津血液研究所。 ORF5的引物。 S2：5’ 预期扩增长度为852bp。 W2：5’一GCGCGGCCGCTCATGGCGTGTAG一3’ 预期扩增长度为702bp。 并由上海博亚生物公司合成。 1．5 ×PCR dNTPs Buffer5ul，25pmol／L上、下游引物各2ul，10mmol／L E 板2ui，水34ul，Taqlul。9512预变性5min，循环参数为94(2 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 应结束后取5ul 物对分别进行PCR鉴定。鉴定正确的克隆摇菌后送上海博亚公司测序。 1．7 染。COSl细胞长至80％汇合时进行转染，操作按转染试剂盒说明书进行。转染后72小时进行检测。 1．8RT-PC 4ul dNTPsMixturelulRNaseInMbitor 溶液12．5ul，5×buffer10retool／L Rtase 或ORF5的下游引物各lul，AMV 检查，反应条件同上。全部反应结束后取5ulPCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检查。 1．9免疫组化检测瞬间表达情况：将合适浓度的细胞涂于细胞涂于细胞片上，晾干后，95％乙醇10 的HRP标记的二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，再用50mM 入DAB显色液室内温3一i0分钟，待出现棕色细胞而背景无非特异性染色为度，用去离子水冲洗中止 显色，观察照相。 2、结果 2．1 板进行PCR扩增，取5ul 核双表达载体插入片段正确。 2．2 扩增出特异性条带，大小与预期大小相近，而用所提取的RNA进行的PCR检测也可以扩增出特异性条 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 成阴性，镜检看不到染成棕色的细胞(图略)。 3、讨论 ORF3及ORF5的真核双表达载体S—W—PIRES。 构建成功的3个真核表达载体转染COS细胞后应用Invitrogen公司的Trizol 过Northen杂交检测目的基因mRNA的转录情况，或通过Westernblot等方法检测目的蛋自的表达 情况。本研究采用免疫组化检测转染细胞目的蛋白的表达，成功观察到染成棕色的阳性细胞，而阴性对 照则观察不到棕色细胞，说明所构建的双表达载体可成功表达PRRSV山东株的2个蛋白。 核酸疫苗出现10年来，因其克服了传统疫苗的免疫原性差或易返强等缺点越来越受到重视，人用 及兽用核酸疫苗的研究正如日中天。目前国际上还没有商品化的核酸疫苗出现，许多人用及兽用核酸疫 苗已进入临床研究阶段。许多哺乳