猪水肿病大肠杆菌分离鉴定及fedF基因克隆和表达的研讨.pdfVIP

猪水肿粕人肠杆菌分离掺定艟fedF皋【判克降，，表达的{引宄 中文摘要 Of DiseaseSwine，ED)。 1938年Shanks首先报道了猪水肿病(Edema 引起的。后来，猪水肿病在世界各地都有发生，我国也常见报道，是多年来困扰 我国养猪业的问题之一。猪水肿病呈地方性流行，或零星散发。在发病的猪群中， 发病率为30～40％，该病死亡率高，可达80％～100％。该病受地区环境、季节气候、 饲养管理条件的影响很大。该病主要发生在断乳后1～2周的仔猪，尤其在发育良 好的仔猪群，造成很大的经济损失，是断奶仔猪危害较严重的疾病。该菌能产生 Vero细胞毒素，且其毒紊可被抗志贺氏毒素抗血清中和，又称为志贺样毒素大肠 toxinicEscherichia 杆菌(Shiga．1ike 病的主要病原，它能损伤血管内皮细胞，或引起细胞坏死和组织病变：除了SLT-IIe 毒素之外，其另外一个毒力因子为菌毛F18，它有助于细菌在猪肠黏膜上皮定居与 繁殖；部分菌株可能还产生LT及ST。 本研究分离了57株致猪水肿病大肠杆菌，对其中7株进行了形态学、培养特 性试验、生化特征、致病性试验、毒力因子的PCR检测的研究。结果表明，上述 7株菌形态学、培养特性试验、生化特征符合大肠杆菌，对小鼠有较强的致病性， 引起小鼠死亡；7株菌肉汤培养物的无菌滤液能致死小鼠且剖检见相关脏器水肿； 性，对LTl及STl扩增，则全为阴性。7株药敏试验证明各菌株的耐药谱不同。 7菌株感染断奶仔猪，均能复制水肿病。 本研究挑选菌株ED3(0139)，该菌对小鼠致病力最大，测定了其对小鼠的半 CFU。另外制备了多价 数致死量(LD50)，该菌对小鼠的半数致死量为2．55×108 灭活菌体抗原，对其小鼠的免疫原性进行了研究。我们用微量凝集法对菌体抗体进 天仍然维持较高抗体效价1：64。 F18菌毛是致猪水肿病的产Vero细胞毒素大肠(VTEC)及某些产肠毒素大 因子。本研究建立了fedF的PCR检测方法，对404株致病性大肠杆菌进行了扩 增，其中48株阳性，阳性率为11．9％。 根据Genbank的序列设计两对引物，用PCR的方法扩增了大肠杆菌菌毛F18 基因的主要亚基fedF的全长及去掉信号肽的亚克隆，扩增的片段大小约为1．0kb 及0．9kb。将纯化的扩增产物克隆到pMD．18T中，上下游酶切位点为Sacl、 #中农业人学颂I岸位论文 Hindlll，酶切分析证实所得阳性克隆，序列分析结果表明，含酶切位点的全长为 967 bp，编码300个氨基酸的蛋白质，碱基 bp，鄂E株fedF基因编码区全长903 序列同107／86株相比同源性为100％。与菌毛AF／RI比较，编码的蛋白质没有同 源性，fedF基因高度保守，是研制疫苗的良好候选基因。用pGEX—KG构建了 特异性表达带， Westernblot结果表明表达的蛋白质具有免疫原性。制备的抗血 coli与刷状缘细胞的黏附。为基 清具有生物学活性，能抑制菌毛F18+Escherichia 因工程亚单位苗及新型疫苗的研制打下了坚实的基础。 关键词 猪水肿病大肠杆菌：分离鉴定；半数致死量；多价灭活抗原；fedF基 因；克隆与序列分析；原核表达 猪水肿粕大肠杆菌讣离举定肢fedF皋吲克隆1』表边的研究 Abstract Edemadiseaseof first Shanksin1938．EDisafatal swine(ED)was reportedby caused disease certain ofEscherichia