生物工程实验.ppt

一、实验目的 1、学习掌握重组子的筛选与验证 2、掌握碱裂解法提取质粒DNA。 3、掌握质粒的酶切电泳鉴定 1）碱裂解提取质粒原理： 主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。 二、实验原理 二、实验原理 1）碱裂解提取质粒原理： 主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。 收集菌体并用GTE悬浮 NaOH SDS 裂解 变性 二者都沉淀 加入KAC 小分子蛋白 大分子不溶性蛋白和残渣 离心分离 取上清 异丙醇沉淀 质粒DNA 苯酚-氯仿除蛋白 获得较纯净质粒 染色体DNA 二、实验原理 2）琼脂糖凝胶电泳：agarose gel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子浪的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关。如质粒开环DNA线性DNA共价闭合环状DNA 3）限制性核酸内切酶: 是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自身DNA，限制外源DNA。①4-6碱基对，具有回纹结构的DNA片段；②水解DNA分子的磷酸二酯键③切割方式有两种：黏性末端和平末端 ④切4碱基，平均256bp出现一次切点，切6-8碱基时，每隔4-65kb出现一次切点 二、实验原理 实验步骤PET-28a-Mn-SOD表达重组质粒的鉴定 1、用灭菌牙签分别挑取5个菌落接种到2ml LB-Km（50ug/ml）液体培养基中，37℃振荡培养过夜； 2、用碱裂解法提取质粒； 3、用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒，1.0 % 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果：切出600bp Mn-SOD基因DNA片段的为阳性克隆。 流 程 图 三、实验步骤 一、质粒DNA的提取： 1. 在含抗生素、IPTG和X-gal的平板上随机挑出数个白色菌落，接种到5ml LB-AMP液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长期。 2. 取1.5ml对数生长期的菌体与EP管中，在台式离心机上8000rpm离心30秒收集菌体。 3. 弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 4. 加100ul GTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5分钟。 5. 加入200ul NaOH-SDS溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴5分钟。 6. 加入150ul预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。 7. 在4℃下于台式高速离心机12000rpm离心5分钟，并将上清移至另一支新的EP管中。 加等体积的酚、氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中，加等体积氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中。 8. 加0.6倍体积异丙醇，置冰浴30min，12000rpm离心10分钟，弃上清。 9. 沉淀用70%乙醇0.5ml洗一次，弃上清并真空干燥。用30ulTE（已加入2ug/ul Rnase）溶液溶解沉淀的DNA，37℃10min，置于4℃保存。 三、实验步骤 3、质粒的酶切鉴定： 1） 质粒DNA酶切反应体系 10?酶切buffer 3 ?l 质粒DNA 10 ?l EcoR1（10u/?l） 1 ?l BamH1（ 10u/?l ） 1 ?l ddH2O加至 20 ?l 37℃水浴保温1-2h；72 ℃水浴15min终止反应。 3、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前） 4、结果分析 三、实验步骤 2、琼脂糖凝胶电泳鉴定：DNA电泳时间为30-60min 1）用电泳缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，冷却至60℃后加入终浓度0.5ug/ml的EB-紫外下的显色物质 2）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳缓冲液的液面高出凝胶。 3）取20ulPCR产物，加入4ul 6?的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微量进样器小心加入样品孔。 4）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以5V/cm的电压电泳30-60min。 5）电泳结束后，带手套取出凝胶置透明薄膜上，紫外灯下观察结果 四、注意事项 1、抽提质粒过程应尽量保持低温 2、质粒制备过程中要尽量除去蛋白，否则会影响后面的酶切或连接 3、沉淀DNA常用等体积的异丙醇，但易将盐也沉淀下来，可以用二倍体积的冰乙醇避免盐的沉淀。 4、EB是强致癌物，注意操作安全； 5、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA