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病毒分离培养的细胞培养法
第18章 病毒分离培养的细胞培养法
一、细胞培养用于病毒研究的优点:
细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛,除用作病毒的病原分离外,还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性和传染性(细胞的病理变化及包涵体的形成)。观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变,探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制,以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性,可用于病毒的分离鉴定,抗原的制备及疫苗,干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。近年来,可用于繁殖病毒载体以用于基因治疗。
应用细胞培养来研究病毒有下列优点:
1、没有隐性感染:动物可能带有某些病毒的隐性感染,往往有干扰作用和假阳性出现。细胞培养一方面是来源于动物部分组织,减少了隐性感染的机会,另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。
2、没有免疫力:动物经隐性感染获得免疫力,对接种病毒会发生抵抗,但由于后天免疫一般不表现在细胞抵抗力的增加,因此离体细胞无免疫力,利于病毒生长。
3、容易选择易感细胞:细胞来源方便,可供作病毒敏感性的筛选,可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求,同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。
4、接种量大:动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制,细胞不仅可以大量生产,而且还可较久地持续培养,便于病毒生长,特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。
5、培养条件易于控制:由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分,因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。
6、提高了疫苗的产量和质量:细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求,而且异性蛋白少,引起变态反应机会少。疫苗中污染菌少或无,可随制随用,成本低,来源方便,便于贮存,且效力均匀,易标准化。
7、加速病毒分离过程:病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高,而且分离过程可显著加速早出结果,但应用对该病毒敏感的细胞。
二、用细胞培养分离病毒
(一)接种标本的处理:
1、粪便标本:用于分离肠道病毒之粪便标本放入装玻璃珠40ml沉淀管内,大约每2克粪便用15ml Hanks液稀释(其余粪便于-20℃保存备用),用橡皮塞紧后剧烈振摇,使粪便乳化,经2500r/min沉淀15分钟后,按将上清用无菌八层纱布过滤,于4℃以10000r/min沉淀1小时再取其上清,1.8ml加入0.2ml抗菌素液进行处理(浓度为25000u/ml的双抗及250mg/L二性霉素B)剩下的悬液保存于-20℃备用。
在4℃下经抗菌素处理的悬液1小时后接种两管猴肾细胞和人二倍体细胞,每管0.25ml,置37℃培养观察细胞病变(CPE)。如果接种材料毒性大出现非特异的细胞退化,则将培养物尽快传代。
2、肛门拭子——肛门拭子擦试后放在约2ml的肉汤内,低温保存,培养前挤出液体于4℃下2500r/min沉淀15分钟,抗菌素处理及接种细胞培养方法同上。
3、咽漱液及咽拭子——呼吸道病毒常取咽嗽液或鼻咽拭子(放在肉汤内)标本,立即接种细胞培养物或保存于-70℃,抗菌素处理方法同上。
抗菌素处理(4℃1小时)后,即可接种两管以上的细胞培养物,每管0.2ml,37℃培养,观察CPE(或血吸附,或干扰现象,依病毒种类而定)。
4、组织悬液:活体检查或尸体解剖取出的组织保存于-70℃,取出此组织选择适当的样品放入无菌平皿内称重,然后移入乳钵内,加入0.75%牛血清白蛋白的缓冲盐溶液磨成20%悬液,若为结缔组织应加入适量铝氧粉研磨。
此悬液经1500r/min沉淀15分钟,吸掉上清,取适量标本经500u/ml双抗处理,4℃下1小时以0.1~0.2ml/(二)病毒的细胞培养
病毒的细胞培养,通常用人胚肾(或VERO猴肾细胞),WISH及FL人胚羊膜细胞,人胚二倍体细胞(WI38、2BS、SL8等)、鸡胚细胞及传代细胞(如Hela细胞,Hep-2细胞和KB细胞)等制备的单层细胞。病毒感染细胞后,大多能引起细胞病变(cytopathic effect, CPE),无需染色可直接在普通光学显微镜下观察,记录时+代表25%以下细胞发生病变,++代表50%左右细胞发生病变,+++代表75%左右,++++代表100%左右细胞发生病变。不同病毒CPE产生的现象不同,有的细胞变园、坏死、破碎或脱落如滤泡性口腔炎病毒(VSV)、B3型柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒等。有的只使细胞变圆,并堆集成葡萄状,如腺病毒。而麻疹病毒,呼吸道合胞病毒形成多核巨细胞或称融合细胞。有些病毒能使细胞形成包涵体,位于细胞浆内或核内,一至数个不等,嗜酸性或嗜碱性。
有的细胞不发生细胞病变,但能改变培养液的pH,或出现红细胞吸附及血凝现象(如流感病毒或副流感病毒、NDV-F、仙台病毒),有的需用免疫荧光技术,或ELISA法检测。用来分离培养病毒常用的细胞如下表2-13
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