各种PCR介绍.pptVIP

PCR工作原理 以要扩增的DNA分子为模板， 以一对与模板5`末端和3`末端互补的寡核甘酸片段为引物 4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下 依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性。 体外(试管中)扩增特异DNA片段短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上 PCR技术 特点 敏感度高、特异性强、产率高、 重复性好、操作简便、快速 PCR体系基本组成 模板DNA： （102-5）拷贝 dNTP底物：20—200umol/L 特异性引物： 0.1—0.5 umol/L DNA聚合酶：Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶:耐热稳定性、5`-3`聚合酶活性及3`-5`外切酶活性，可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。 含Mg2+的缓冲液： Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.5—2.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。 反应分三步： 1 变性 denaturation： 加热90-95℃，模板DNA双链解离形成单链DNA； 2 退火 annealling： 温度突然降低,引物与模板DNA结合, 40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃. 3 延伸 extension： TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+ 存在 的条件下，催化DNA合成。 70-75℃时间---要扩增片段长度决定 PCR产物的检测 琼脂糖凝胶电泳； 分子杂交； 限制性内切酶酶切分析； 微孔板夹心杂交法； 直接测序 PCR新技术 RT-PCR：用于RNA分析 梯度PCR：可用于找出最适合的退火温度 反向PCR：可对未知序列扩增后进行分析 不对称PCR：用于制备单链DNA 多重PCR：加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段 降落PCR：用于PCR条件的优化，避免非特异性序列的扩增 实时定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR) 巢式PCR：使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段 降落PCR（ Touchdown PCR ）用来避免非特异性序列的扩增 PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。 降落PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。 反向PCR (Inverse PCR, IPCR) 扩增引物相反方向DNA?序列的技术。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.? 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。 不对称PCR（ asymmetric PCR ）：用于制备单链DNA PCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的1%（或2%）。 经过PCR循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNA序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的DNA链做模板，继续引导DNA合成。 这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态。 多重PCR 一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。 多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。 梯度PCR（Gradient PCR） 是指我们在摸PCR条件的时候采取的一种手段，因为不能确认引物的最佳退火温度，会采用梯度PCR，同时在不改变其他PCR条件的情况