第五章图像分析与细胞蛋白谱的建立.pptVIP

肽离子不可能在任意位置碎裂，肽段母离子在质谱仪的碰撞室经高流速惰性气体碰撞解离，沿肽链在酰胺键处断裂并形成子离子，形成一个“y离子”和一个“b离子” 肽主链优先携带了键断裂位置，对于母离子信号来说，只有携带至少一个电荷的碎片才能被检测到 当双电荷肽离子断裂成片段时，形成b离子和相应的y离子 当单电荷离子断裂成片段时，形成b离子或y离子，肽的另一半作为中性片段丢失 肽键断裂时，会产生a、b、c型和x、y、z型离子 在一般公认的命名法中， a、b、c型离子保留肽链N端，电荷留在离子的C端；x、y、z离子保留肽链C端，电荷留在离子的N端，下角码显示的是碎片的残基数 MS／MS模式中的肽片段和肽片段的命名 MS／MS谱图的解释原理 b型和y型离子在质图谱中较多见，丰度较高 两个相邻的b离子或y离子的质量差别对应于一个氨基酸残基的质量，从质量差别的系列中，可以完整抽提出和“读”出肽的序列 MS-MS谱图 MS-MS谱图 从N端（左侧）逐渐向C端（右侧），可看到裂解产生了一系列m/z值逐渐升高的肽离子片段（b系列）和一系列互补的m/z值逐渐下降的肽离子片段（y系列） 每个片段带有单电荷 y离子系列 在标记的y7和y6离子之间m/z值之差是71 amu，这相当于一个丙氨酸的残基质量 y6和y5之间的m/z值之差是57 aum，相当于一个甘氨酸 y5和y4之间的差值是103 aum，相当于一个半胱氨酸 AGC MS-MS谱图 b系列 与y离子系列互补 b7和b6之间的差值是57 amu，相当于甘氨酸 b6和b5之间的差值是71 amu，相当于丙氨酸 y和b离子系列从两个不同方向描述相同的氨基酸序列 MS-MS谱图 影响“完美”MS-MS谱图因素 不同肽键产生片段的倾向性不同 裂解依赖于质子化肽离子中质子迁移到不同肽链的酰胺氮的难易程度 容易质子化的位点最容易发生裂解 酸性氨基酸侧链对稳定正电荷也有一定作用 邻近谷氨酸或天冬氨酸的裂解常产生信号强的离子片段 信号最强的离子片段常常是靠近源肽中间的裂解产生的 当肽离子在碰撞中获得能量时，能量在裂解过程中产生竞争性分散，易于裂解的位点会减少其他位点的裂解，使得某些片段离子减少或缺失 影响“完美”MS-MS谱图因素 不同肽键产生片段的倾向性不同 胰蛋白酶肽离子的裂解图型特别重要 胰蛋白肽常带有双电荷 在C端有赖氨酸或精氨酸残基 具有保留正电荷的能力 y离子系列通常比b离子系列的信号强 某些双电荷肽离子的裂解产生一个双电荷产物离子和一个中性片段 MS-MS谱图中的产物的离子可能来自双电荷片段，而不是来自单电荷片段 影响“完美”MS-MS谱图因素 某些氨基酸独有的裂解性质 某些氨基酸侧链产生与肽骨架无关的特定裂解切割 丝氨酸和苏氨酸残基很容易在羟基的侧链脱水 脱水后产生的离子有时会比含有完整丝氨酸或苏氨酸的离子片段在谱图中的信号更强 磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸发生类似去磷酸化 磷酸丢失后形成的离子在MS-MS谱图中占多数 判断磷酸肽的可靠指标 半胱氨酸H2S丢失 天冬氨酸氮的丢失 影响“完美”MS-MS谱图因素 脯氨酸对肽离子裂解的弱化作用 消化 脯氨酸位于赖氨酸或精氨酸的C端一侧，阻碍胰蛋白酶切割 裂解 具有特有的结构 有与α碳和二级酰胺相连的环状侧链 脯氨酸残基的氮没有质子化位点和裂解位点 在脯氨酸不能裂解的位点缺少b或y离子 2、肽序列标签技术 与PMF谱图相比，肽序列谱图相对较为复杂，需要计算软件的帮助计算识别各系列的离子，从图谱中读出完整序列的解析较困难 数据库检索鉴定蛋白质时，可读出部分氨基酸序列结合此肽段序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查询，这一鉴定方法称为肽段序列标签技术(peptides?sequence?tag，PST) PST组成 鉴别某一特定序列（b或y）离子的连续离子元素（如鉴别出相互之间相差一个氨基酸残基的碎片离子），解析出部分序列信息 鉴定出的系列中第一个离子的质量数 肽质量与最后一个离子质量之差（这两个质量数限制了此序列两端未知残基的总质量） 此完整肽段的质量 所用蛋白水解酶的酶切特性（在N端、C端都切还是只切一端） 3、18O标记从头测序技术 为了提高串联质谱数据的解读能力，尤其是对y或b型离子的辨别能力，实现对肽段的从头测序，可利用化学修饰的方法使该种离子具有某种特征，从而易于辨认 18O标记法 18O标记法 蛋白质在酶解时，酶解液中H218O/H216O各占50%，这样酶解后肽段的羧基端上的18O/16O同位素丰度比为1：1，使得y型离子系列（均含有肽链的游离羧基端）的M+2/M的同位素峰的丰度比高于正常未标记18O离子的同位素峰的丰度比，根据这一特征可以较容易地分辨出y系列离子 b离子是单峰，y（具有完整C末端）离子出现成对的质谱峰（质量相差2Da）