细菌原生质体育种技术及其应用进展.pptVIP

细菌原生质体育种技术及其应用进展 报告人：雷用东 目 录 一、前言 二、研究现状 三、细菌原生质体融合育种原理 四、实验过程 五、影响细菌原生质体融合的因素 六、应用进展 七、意义及展望 一、前 言 原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。 一、前 言 原生质体融合育种技术是细菌遗传育种的有效方法之一，发展迅速，应用广泛。文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用，并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。 二、研究现状 细菌原生质体融合是20世纪70年代发展起来的重要基因重组技术。1976年FODORK等采用聚乙二醇（PEG）、磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌原生质体的融合，SCHAEFFEP等报道了用PEG诱导枯草芽孢杆菌的原生质体融合，这2项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技术发展的里程碑，经过30余年的发展，已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。 三、细菌原生质体融合育种原理 (1) 克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。 (2) 基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。 (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。 (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。 四、实验过程 （一）实验材料： 1、菌种： 枯草芽孢杆菌T4412 、枯草芽孢杆菌TT2 四、实验过程 （一）实验材料： 2、 培养基 (1) 完全培养基(CM，液体)； (2) 完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂； (3) 基本培养基(MM)； (4) 补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min； (5) 再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。 (6) 酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。 四、实验过程 （一）实验材料： 5、 促融合剂 40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。 6、 溶菌酶液 酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。 7、器皿 养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器。 四、实验过程 （一）实验材料： 3、 缓冲液 (1) 0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。 (2) 高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。 4、 原生质体稳定液(SMM) 0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1?、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。 四、实验过程 （二）原生质体融合育种流程： 四、实验过程 （三）实验过程 1、选择亲本? 选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。 四、实验过程 2、原生质体的制备 （1）培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。 （2）收集细胞 各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为