细胞侵袭迁移检测.docVIP

细胞侵袭迁移检测 1.2.3 软琼脂集落形成: 参照文献方法[10], 进行软琼脂集落培养实验, 观测PRL-3 siRNA对大肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响. 1.2.4 体外侵袭: 收集转染48 h的细胞, 采用Boyden小室模型[11]检测癌细胞侵袭情况. Boyden小室上室细胞穿过膜上matrigel到膜的下室面, 其数量反映了细胞侵袭能力的大小. 400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数, 以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力. 随机计数5个视野内的细胞数, 取平均值进行统计处理, 每组计数3份样本. 1.2.5 大肠癌细胞裸鼠体内侵袭: 收集各组细胞, 无血清的DMEM洗涤2次后, 准确计数并调整细胞浓度为3×109/L, 将各组细胞接种到裸鼠的皮下, 0.2 mL/只. 28 d后, 断颈处死裸鼠, 解剖裸鼠, 用40 g/L甲醛固定收集的组织, 制片, HE染色, 观察肿瘤细胞在体内有无转移和局部浸润的情况. .2 软琼脂集落形成实验 大肠癌HCT116细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落. 而经PRL-3 siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少(P0.05, 图2). 图2?PRL-3 siRNA转染对大肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响. 2.3 PRL-3 siRNA对肠癌细胞侵袭的影响 本研究采用Boyden小室模型方法采用PRL-3 siRNA转染对大肠癌细胞侵袭能力的影响, 结果发现: 与对照组比较, siRNA组穿过滤膜的癌细胞数明显下降, 且与浓度相关(P0.05, 图3). 图3?PRL-3 siRNA转染对大肠癌HCT116细胞侵袭的影响. 2.4 裸鼠病理组织学 Con-A组和Con-B组癌细胞有较多部位侵犯癌组织周围的横纹肌, 并存在癌细胞侵入血管的现象, 而siRNA转染组未见这些现象. 说明转染组癌细胞体内侵袭能力明显受到抑制. 正常真核细胞, 除成熟血细胞外, 大多须黏附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活, 称为锚着依赖性(anchorage dependence). 肿瘤细胞可以锚着不依赖性生长. 肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少与恶性程度呈正相关. 癌细胞侵袭能力强, 则在软琼脂上形成的集落数目多. 软琼脂集落培养实验和Boyden小室模型实验发现, 经PRL-3 siRNA转染处理的结肠癌细胞软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少, 且呈浓度依赖性. 裸鼠模型实验发现, 对照组癌细胞有多处侵犯肿瘤周围组织, 并存在癌细胞侵入血管的现象, 而PRL-3转染组未出现这些现象. 提示PRL-3下调可抑制大肠癌细胞的体内外侵袭能力. 细胞迁移的实验。 其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。 我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。 材料： 6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中） marker笔 直尺 20微升枪头（灭菌） 无血清培养基 PBS 准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 流程： 1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。 4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。 如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。 一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。 划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。） 划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为 1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。 2。细胞有极性，方便测量，观察。 3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发