我们实验室的SDS-PAGE经验集锦：极其好用!.doc

我们实验室的SDS经验集锦：极其好用! 蛋白SDS电泳及定量在蛋白质技术手册[5]基础上，根据实验条件的方便修改。请仔细看各种细节改良，各种操作效果经本实验室5年验证。 【一】 储存液配制（注意配方和实际测定参数！！！） （1）2 M Tris-HCl (实测pH 8.9±0.1，25℃) 500 mL：121 g Tris base加350 mL双蒸水溶解，以玻璃棒搅拌约1 min，缓慢加入浓盐酸（11.8 M）20 mL，继续搅拌均匀，并使Tris全部溶解，溶液澄清，加入适量双蒸水至500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。 （2）100 g/L SDS 溶液： 10 g SDS （要求高纯度，其质量明显影响电泳效果）加100 mL双蒸水，于洁净的250 mL烧杯中进行微波加热溶解，注意不要爆沸，间歇用玻璃棒搅拌以加速溶解，完全溶解后的溶液应清澈透明无色。倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化。 （3）75%（v/v）甘油：于500 mL量筒中倒入分析纯甘油300 mL，加双蒸水100 mL，以一次性塑料手套封口，颠倒量筒使甘油完全溶解，然后倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。 （4）10 g/L 溴酚蓝溶液：500 mg溴酚蓝加双蒸水50 mL，搅拌溶解，倒入棕色玻璃试剂瓶中，4 ℃冰箱保存。不用过滤。用时注意吸取上层澄清液，不要吸到沉淀。 【二】电泳工作液配制（省劲好用！！！） （1）Acr-Bis液（丙烯酰胺溶液）500 mL：于800 mL洁净的烧杯中，依次称取双丙烯酰胺4 g，丙烯酰胺146 g，缓慢倒入双蒸水约350 mL，以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中，所以要称重时注意周围空气流速，称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双丙烯酰胺掩盖。玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并扩散到空气中。完全溶解的溶液应清澈无色透明。待溶解完全后补加双蒸水至500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱可保存10个月。 （2）4×分离胶缓冲液，500 mL：于500 mL洁净的量筒中，依次加入375 mL 2 M Tris-HCl (实测pH 8.9±0.1，25℃)， 100 g/L SDS 溶液（冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化）20 mL，最后加入适量双蒸水至500 mL。倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存12个月。有时冰箱温度过低会使储存液混浊，微波略微加热使其澄清后即可使用。 （3）100 g/L 过硫酸铵溶液 (ammonium persulfate, AP)20 mL：2g过硫酸铵加20 mL 双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存10个月。注意配胶时不要交叉污染TEMED，可以以5 mL分装到4个无色塑料试剂瓶中分别保存。 （4）TEMED 成品液：购买后分装成2或5 mL小管装使用可避免母液受到污染。 （5）5×样品缓冲液，100 mL：依次加入50 mL 75%（v/v）甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液，10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液，5 mL 2 M Tris-HCl (实测pH8.9±0.1，25℃)，5 mL巯基乙醇，9 mL双蒸水。混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱至少可保存12个月。可分装成10 mL使用，不会使母液受到蛋白污染。 （6）10×电泳缓冲液，1000 mL： 称取10 g SDS，30 g Tris base，144g 甘氨酸（事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色的产品）于1000 mL的烧杯中，加水约700 mL溶解，可微波炉加热（ 80℃）以促进溶解，注意不要使其沸腾，加热至烧杯烫手即可，间歇用玻璃棒搅拌。分装至无色玻璃试剂瓶中，室温最少可保存6个月。其pH值约为pH 8.4±0.1。 【注意可省去pH6.8的浓缩胶缓冲液，用4×分离胶缓冲液pH8.9的替代即可】 【三】12% 电泳胶的配制 要注意的是，配胶时分离胶的五个组分按下表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以枪头搅拌约10-20 sec，灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的水层（这可使凝固后的胶面平滑整齐），然后于37℃凝固15-30 min。而在配胶时浓缩胶只加前三个组分，混合液要于4℃冰箱保存，待分离胶凝固后再取出加入AP和TEMED溶液，枪头搅拌均匀，灌胶后插入梳子，然后于37℃凝固15-30 min。凝固的胶连带其附着的玻璃板用塑料薄膜严密包裹可在4℃冰箱保存2-4天，长时间保存易干胶，要重新做胶。 12.5% 电泳胶的配制（10mL) Table 12.5% Gel components Reagents Seperating