第6章 膜亲和过滤.pptVIP

6 膜亲和过滤法 1.生物亲和作用 2 亲和膜分离技术 2.3 亲和膜分离过程 2.4 亲和膜对膜材料的要求 举例：IgG的亲和膜分离 1.起始膜材料的选择：细胞的尺寸大于10μm，蛋白质小于0.01μm－选择中空纤维微滤膜 2.膜表面的预处理：聚砜类微孔膜表面改性亲水化（－OH） 3.接配基反应－表氯醇法活化羟基，将配基L－NH2偶联在膜上 4.膜分离 a.细胞培养液IgG单抗液（pH8.0）引入膜中错流过滤 b. PBS 淋洗杂质 c.洗脱－pH3.5 PBS d.膜再生－pH8.0 PBS 3 亲和－膜过滤 3.3分离过程 （1）亲和载体与蛋白质→复合体 （2）膜分离－蛋白质复合体被截留，杂蛋白随液体透过膜 （3）复合体中蛋白质释放－改变缓冲溶液 （4）膜分离－亲和载体被截留，目标蛋白透过膜 （5）亲和载体的再生 4-6章复习题 1.简述各种膜分离方法的原理及应用 2.超滤膜的截留率与回收率、浓缩倍数的关系 3.膜组件种类及特点 4.亲和膜分离技术与亲和膜过滤的区别 5.纳滤的原理及特点 * 亲和膜分离技术 亲和膜过滤 1.1亲和作用的本质 具有亲和作用的分子对具有“钥匙”和“锁孔”的关系，在结构互补的部位通过静电作用、氢键、疏水相互作用、配位键、弱共价键相互结合。 1.2亲和分离技术 被认为是解决生物工程下游产品回收和纯化的高效方法。主要有亲和分配、亲和沉淀、亲和色谱等技术正在迅速发展，其中亲和色谱已成为色谱领域中的一个重要分支，它的选择性和特异性极强，是其他技术无法比拟的。 亲和色谱的不足：流速低、扩散传递慢，不易大规模应用。 1.3 膜分离技术具有高效快捷、操作方便、易于自动化等特点，适合工业大规模生产，但单独使用膜分离，难以达到较好的分离效果。 1.4 膜亲和过滤技术 就是将膜分离技术与亲和分离有机结合，发挥各自长处的重要分离手段，它包括两项技术： ①亲和膜分离技术，制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离; ②亲和－错流膜过滤，将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与产物进行特异反应，然后用膜进行错流过滤。 亲和膜分离原理 2.1 原理 亲和膜分离是利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和层析的变型，又叫膜亲和层析。 2.2 特点 传质阻力小、压力小、配基利用率高、流速快 （1） 分离膜的改性－一个间隔臂(Spacer), ≥3C （2 ）亲和膜制备－一个适合的亲和配基(Ligand) （3 ）亲和络合 －配基和配位物(Ligate)为一体的复合物(Complex) （4 ）洗脱－改变条件，如洗脱液的组成、pH值、离子强度、温度等，使复合物产生解离,并将解离物收集起来，进一步处理。 （5 ）亲和膜再生－将解离后的亲和膜进行洗涤、再生、平衡，以备下次分离操作时再用。 1 2 3 4 5 （1 ）膜表面要有足够多并可利用的化学基团(一般为-OH，-NH2，－SH或－COOH基)，使其能进行活化，接上合适的间隔臂和配基。 （2 ）要有足够数量可利用的化学基团则必需有足够高的表面积，要便于让生物大分子自由地出入膜，必需有足够大的孔径。 （3 ）孔分布应窄而均匀，以获得高的通透量和分离效能。 （4） 为了实现快速分离，常要加压操作，因此要求膜有一定的机械强度，能承受一定的压力，长期使用不变形。 （5 ）亲和膜要耐酸、耐碱、耐高浓度的缓冲液和有机溶剂。 常见的有：葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、多孔玻璃和硅胶等 2.5 亲和膜分离技术的应用 一些亲和膜的特征和应用 3.1 原理 亲和-膜过滤又称亲和过滤或亲和错流过滤 (Affinity Cross-Flow Filtration),是一种新型大规模分离纯化技术。这一技术是生物化学、化学工程和生物工程等多门学科的前沿交叉点，它将亲和层析和膜过滤特别是超滤技术有机地结合起来，兼有亲和层析和膜过滤的优点，从而成为目前研究的热点。 3.2 亲和载体 3.2.1亲和 载体结构 内核 特定基团 生物分子无特异吸附性 对所提取的蛋白质有一定的特异吸附性 载体的内核的类型 1.水溶性的大相对分子质量聚合物：载体与分离对象的结合更为有效并更为迅速，表面基团在与蛋白结合时，消除了空间障碍，大大提高了过程速率。 2.非水溶性的粒子：粒子具有尽量大的表面积，也就是说要求粒子的直径尽可能小。 3.2.2亲和载体的制备 1.先于载体粒子上嫁接间隔臂后，再共价结合亲和配基； 2.间隔臂与亲和配基共价结合后，与载体粒子相连。 亲和－错流过滤流程总图 亲和-膜过滤纯化伴刀豆蛋白A的实验装置 分子量102k,截断1000k 3.3 亲和-膜过滤的应用