有氧胁迫下幽门螺杆菌球形变异相关蛋白的鉴定及功能研讨.pdfVIP

生物技术 有氧胁迫下幽门螺杆菌球形变异相关蛋白的鉴定 及功能研究 曾浩 重庆市第三军医大学临床微生物学及免疫学教研室，重庆，400038 摘要 目的：研究有氧胁迫下H．pylofi由螺旋体转变成球形体的适应性调节蛋白．方法：运用 将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索。结果：获得6个与H．pylori球形 述蛋白的鉴定为深入研究有氧胁迫下H．pylori球形体的形成机制，筛选具有潜在价值的抗 H．pylori药物靶位和疫苗候选靶位具有参考价值。 关键词 豳门螺杆菌；球形体；比较蛋白质组学；活性氧代谢 幽门螺杆菌(Helicobacter form)转变为球形体(coccoid (spiral 染的复发中可能起着重要的作用嘲。H．pylofi作为一种专性微需氧菌，在体外及牙菌斑等与大气充分接触 的高氧浓度生长环境下，极易发生球形变异，以球形体的形式长期稳定存在，在适宜的条件下，可能通过 粪一口、口一口等传播途径引起H．pylori的感染和复发。目前对其形成的本质仍不清楚。本研究拟采用高 在价值的抗H．pylori药物靶位和疫苗候选表位提供参考。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1菌株 实验用HpMl3菌株自重庆市西南医院慢性胃炎患者胃黏膜组织分离鉴定，通过连续感染沙土鼠13代 后获得。 1．1．2试剂 IPG胶条、IPG 公司)；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。 1．1．3仪器 ProteanIEF II垂直电泳系统、ChemiDoe化学发光成像系统(美国 system等电聚焦系统、Protean 谱(德国Brucker公司)。 273 中国科协第四届优秀傅士生学术年会论文集 II 1．2方法 1．2．1 H．pylori的培养 染色镜检观察菌落形态。 1．2．2 H．pylori球形体的诱变 1．2．3 H．pylori球形体转化MTT实验 从培养球形体时开始做MTT实验。每4h1次，共12次。取100“L菌液(约107细菌)于离心管中，3000 后溶液置于96微孔板于570nm下读数。实验设阴性对照组。 1．2．4 Culturable Counts，SCC)实验 H．pylori球形体表面培养计数(Sufface SCC实验与M兀实验同步进行。利用球形体在体外不能用实验手段培养的特性，用SCC实验来计算 数目，计算球形体的转化率。 1．2．5双向凝胶电泳和肽质量指纹图谱分析 参考文献【3】进行。提取H．pylori螺旋体和球形体的菌体蛋白，选择pH IEF II 干胶条，取1500pg菌体蛋白，用Proteansystem系统进行第一相固相pH梯度等电聚焦，然后用Protean 质谱(MALDI．TOF—MS)进行肽质量指纹图谱分析。 1．2．6蛋白质序列数据库检索 Peptident数据库(http：／／www．expasy．ch／tools／peptident．htm)进行检索。 1．2．7 H．pylori球形体酶活性检测 说明书进行，试验孑L加菌量1010cfu／rr儿，菌液l叫L，。按反应颜色深浅，酶活性从强到弱依次定为“卅”、 “++”、“+”、“．”四个等级。过氧化氢酶检测由细菌悬液与3％过氧化氢反应获得。SOD表达活性检测用 黄嘌呤氧化酶法按试剂盒说明书进行。计算公式为： SOD活性(N-U／mgprot)：生譬尘型 A对照管 +50％x然+蛋白质含量 注：NU／mgprot．亚硝酸盐单位，毫克蛋白 2结果 2．1 H．pylori球形体