串联表达PRRSV GP3、GP4与GP5重组腺病毒的构建与免疫特性研讨.pdfVIP

兽医部分 799 串联表达PRRSVGP3、GP4与GP5重组腺病毒的构建 与免疫特性研究+ 蒋文明“ 姜平一 李玉峰王先炜 (南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 江苏南京210095) 摘要：利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP3与GP4基因，按正确的读码框与GP5基因单独或同时串联， 个基因的穿梭栽体。PCR、测序鉴定正确。PineI线性化后在BJ5183大肠杆茵内与腺病毒骨架栽体pAdr卿一l同源重组， 产生重组腺病毒DNA。将重组腺病毒DNA经PacI线性化后脂质体法转染HEK一293A细胞，包装成完整的腺病毒。WA 和Western 腺病毒构建成功，可以正确的表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠，结果表明三种方式串联的重组腺病毒比单 基因重组腺病毒可以诱导产生更强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CrL反 应)。这说明三种方式串联的重组腺病毒具有更好的免疫原性，为下一步猪体免疫试验奠定了基础。 关键词：PRRSV；GP3；GP4；GP5；重组腺病毒；体液免疫；细胞免疫。 猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的、以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪的 呼吸道症状为特征的一种传染病。本病给世界和我国养猪业造成了巨大的经济损失，现已成为危害规模 化养猪生产的主要疫病之一。 的GP3、GP4、GP5蛋白是病毒的囊膜糖蛋白，它们在病毒的致病性、病毒复制、病毒装配、病毒变异和保护 建了单基因或多基因串联的重组腺病毒，小鼠免疫试验表明串联后具有更好的免疫原性，为研制安全有 效的PRRSV基因工程疫苗奠定基础。 1材料与方法 1．1病毒、细胞及主要试剂 表达PRRSV GP3、GP4、GP5蛋白的3T3细胞系)由本实验室培育保存。鼠抗PRRSVGP3、GP4、GP5蛋白特 异性抗体由本实验室制备保存。 1．2 PRRSV S1株GP3、GP4、GP5基因扩增 参照PRRSV ·基金项目：国家自然科学基30270990，新世纪优秀人才支持计划(NCrlTm20502)。 163．COlllo ·¨通讯作者。TH：嘶一25E—mail．ji哪@njau．。d11．cn。 2006学术年会 1．3重组腺病毒的构建 作。将构建好的各穿梭载体用Pine 至BJ5183感受态细胞，进行同源重组。用卡那霉素筛选获得重组病毒DNA，Pac I酶切鉴定。用QIAGEN PlasmidMini Transfection I酶切回收后，用TransFastTM Kit(Invitrogen)提取纯化重组腺病毒DNA，Pac Reagent (Promega)转染HEK一293A细胞，培养10～15d，获得重组腺病毒。 1．4重组腺病毒目的蛋白的表达鉴定 1．4．1 间接免疫荧光试验(IFA)：重组腺病毒接种293细胞后24h，加入100皿的冷乙醇，4℃固定30 min；将鼠抗GP3、GP4、GP5蛋白特异性抗体分别作1：50稀释，每孔加入100出，37。C温育30min；PBS洗涤6 次；每孔加入100皿的1：100稀释的FITC一羊抗鼠is,G(博士德)，37。C温育30mln；PBS洗涤6次；于荧光显 微镜下观察。 1．4．2Westem 带。 1．5小鼠免疫试验 取脾脏，分离淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应和CTL反应。 1．6 ELISA抗体测定 最后以OPD显色，测定OD490nnl的值。以S／P，0．3且OD锄0．4判为阳性。 1．7病毒中和试验 待检血清56。C灭活30min后，作2的连续倍比稀释，然后与等体积的病毒液(含200