串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研讨.pdfVIP

猪传染病 3讨论 PRRSV单抗研制国内外．甲．有报道，本实验室也曾制备了抗PRRSV的单抗，但在实际 使用中，效果并不理想。采用合适的抗原和抗体筛选方法，避免免疫抗原和检测抗原中杂蛋 白的干扰是研制单克隆抗体的关键因素。由于PRRSV纯化工作难度较大，病毒粒子虽经纯 化，但其中仍有部分杂蛋白，如采用纯化的PRRSV作为免疫原，再用该抗原作为ELISA抗原 筛选单抗，就会出现大最假阳性结果。因此，本研究在免疫时采用DNA免疫方法，而单抗 筛选抗原采用纯化的PRRSV。目前，用质粒免疫的方法制备PRRSV单抗尚未见报道，本 实验采用此种方法，取得了较好的效果。 DNA免疫将目的基因赢接注射机体组织，目的抗原可以通过自然途径在细胞中表达， 30n3-成抗原肽后递呈给免疫系统，此途径与病毒感染相似，能够更有效的致敏淋巴细胞，引 起广泛的体液免疫和细胞免疫应答。 ORF5编码糖基化囊膜蛋白GP5，具有6个抗原决定簇，其中至少有四个连续表位。在 这4个连续表位中，有3个为中和表位，1个为非中和表位。这些表位由McAbslSU25AI 汞JB1以及Pirzad 别。其中有一个是血清特异性的线性决定簇，能在体外中和病毒的感染。 重组蛋白基因大小有关，本试验采用的重组蛋白为GP5基因3’端缺失37个氨基酸而构建的 重组蛋白。有关报道表明，GP5蛋白的中和性表位在37氨基酸之后。在中和试验中，单抗 5D10、5F12有中和病毒的作用，而4C9没有，这也与报道相吻合。因此单抗4C9可能识别 GP5蛋白3’端的某个抗原位点，与5D10和5F12识别的抗原位点不同。 5D10和5F12是中和性单抗，因此在皿型鉴定、相对亲和力测定，以及抗原结合位点上， 进行了着重分析。结果表明这2株单抗是针对GP5蛋白的不同表位，并具有不同的血清学 特性，从而为PRRSV抗原表位和诊断方法的研究提供了有用1具。 参考文献略 串联表达PRRSVM与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其 免疫特性研究 蒋’文明，姜平·，李玉峰，汤景元，王先炜，杜以军 南京农业大学农业部动物疫稿诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京210095 摘要利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因，按正确的读码框与GP5基因串联，成功构 建穿梭载体pShuttlc．CMV-M．GP5，经PCR，测序鉴定正确。PmcI线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病 毒骨架载体pAdEasy．1同源重组，产生重组腺病毒DNA．重组腺病毒DNA经PacI线性化后用脂质体转 染HEK·293A细胞，在细胞内包装成完整的腺病毒，通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构 建成功，可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠，结果表明可以诱导产生较强的体液 免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和cTL反应)．证明谈重组腺病毒具 有较好的免疫原性，为下一步猪体免疫试验奠定了基础。 关键词PRRSV，M，GP5，重组腺病毒，体液免疫，细胞免疫 猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine and reproductiverespiratory syndromevirus，PRRSV)引起的、以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状为特征的一种 传染病¨2 J。本病给世界和我国养猪业造成了巨大的经济损失，现已成为危害规模化养猪生 产的主要疫病之一。 病毒的致病性、病毒复制、病毒装配、病毒变异和保护性反应等方面可能具有重要意义。 并能检测到细胞免疫应答。攻毒保护试验证实用BCG表达的PRRSVGP5、M蛋白能够提 一192． 第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会2006年会议论文集 供部分的免疫保护14】。Plana等报道用杆状病毒表达的GP5蛋白免疫母猪，对怀孕母猪提供 真核重组质粒分别免疫猪后攻毒，发现用ORF5免疫的猪中和抗体滴度最高【7J。此外，有研 究表明GP5有可能参与病毒粒子结合病毒受体的过程捧J。因此，M、GP5蛋白在PRRSV的 致病性、预防与控制等方面具有重要意义。 腺病毒被认为是重组病毒疫苗的有效载体之一。重组腺病毒在基因工程疫苗方面具有广 阔的应用前景，尤其是复制缺陷型腺病毒载体的研究。本研究利用腺病