遗传学精品课件（中国农业大学）12 第十二章（遗传工程）-1.pptVIP

基因工程 定义：利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。 基因工程的特点 1、跨越天然物种屏障，实现动物、植物、微生物间的遗传物质交换。 2、只定向改变一个或少数几个性状，而不改变品种的其他特性。 3、可以人为控制基因的表达。 第二节 基因的分离 基因克隆通常包括三个步骤： 1）目标DNA片段（基因）的分离； 2）目标基因克隆到载体上； 3）载体导入宿主细胞并在其中大量复制。 一、工具酶 细菌细胞具有防御异源遗传物质（病毒）的进入的能力，异源DNA分子进入后，会被限制酶识别并降解，这个过程称为限制。 Ⅱ型酶有几个基本特性 ① 在DNA分子上有特异识别和切割的序列部位，使被切割的DNA分子形成单链的断裂； ② DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的； ③ 断裂结果所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接； ④ 内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即该类内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，只需要Mg2+来激活，不需要ATP辅助因子。 （二）DNA连接酶 能催化DNA中相邻的 3’ –OH和5’ – 磷酸基 末端之间形成磷酸二酯 键并把两段DNA连接起 来。 （三）反转录酶 反转录酶（reverse transcriptase）是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合酶。 （四）聚合酶链式反应 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） PCR反应在一种混合液中进行（PCR mixture）包括四种主要成分：两个引物（一般为20 bp）；模板DNA；热稳定的DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸。 聚合酶是Taq酶（AmpliTaq polymerase，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）。 PCR反应已经自动化，在PCR仪（thermocycler）上进行。 基本过程： 通过高温，双链DNA变成单链DNA——变性； 通过降低温度，使引物和摸板配对——退火; 利用耐热DNA聚合酶,合成产物DNA——延伸。 变性温度：93-94 ℃， 30-60秒 退火温度：36-60 ℃, 30-60秒 延伸温度：72 ℃, 1.5-2分 循环30-40次; 最后72 ℃补齐10分钟。 二、载体(vector) （一）重组DNA技术 重组DNA（recombinant DNA）主要指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子。 重组DNA的步骤 （1）从细胞或组织获得DNA并纯化； （2）用限制酶切割DNA； （3）将获得的限制片段连接到载体上。 （4）重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内重组DNA分子复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子，称为克隆； （5）克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化； （6）克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业开发。 （二）载体(vector) 作为载体DNA分子，必须储备的4个条件： 1、质粒载体 质粒：细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。 质粒载体含有 LacZ基因的N端编码序列，在编码区含有多克隆位点，不影响酶的活性，选择含有β-半乳糖苷酶C端片段的宿主细胞。 在含有X-gal（5-溴-4-氢-3-吲哚- β –D-半乳糖苷）的培养基中形成兰色菌落，但如果外源DNA插入到多克隆位点，将绝对地产生不具有α互补功能的N端片段产生，菌斑为白色。 2、病毒载体 λ噬菌体载体可以接受15~23kb的外源DNA片段 细菌人工染色体（BAC） 可以克隆300kb左右片段 酵母人工染色体（YAC） YAC载体可以插入大片段的DNA（1-2Mb） 三、基因的分离 （一）从基因文库中分离基因 基因文库：是由单一来源的特定组织或器官的DNA或cDNA片段汇总形成的克隆群体。 cDNA文库与基因组文库的不同 基因组文库代表了基因组中的所有基因，而cDNA文库仅代表某一特定细胞类型，某一组织，或某一胚胎发育时期的表达序列。 2．从基因库中分离特定的克隆序列(基因) （1） DNA探针 探针是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核酸序列。利用DNA探针可以从基因库中筛选特定的克隆 通常探针用同位素标记，但也可使用荧光标记或颜色反应标记探针。探针可以有多种来源，如果筛选植物基因，探针可以来源于植物本身，也可以来源于异源植物、动物中的同类基因的保守序列。 （3）阳性克隆的分析与鉴定 从文库中筛