植物乳杆菌产细菌素LP9的分离提取研究.pdfVIP

植物乳杆菌产细菌素LP9的分离提取 贾士儒‘李琳谭之磊高玉荣王国良范宝庆莫治文 7) (天津科技大学，工业微生物教育部重点实验室，天津，30045 摘要：本文对一株植物乳杆菌所产的细菌素LP9进行了提取。采用丙酮沉淀法、乙醇沉淀法和 DH吸附释放法等方法对植物乳杆菌细菌素进行粗提，发现植物乳杆菌素LP9的提取以乙醇沉淀法最 为适宜。通过对提取工艺进行优化，结果表明当乙醇饱和度为70％，沉淀时间为4h时，对植物乳杆 菌细菌素LP9的提取效果最佳，收率达32．0％。 关键词：细菌素；植物乳杆菌；分离提取 细菌素是由细菌产生的具有抗菌活性的多肽或蛋白质，通常对与产生菌种属相近的 其他细菌有抑制作用。由乳酸菌产生的细菌素由于其安全性高而引起研究者的关注。目 前，产细菌素菌种的筛选与细菌素性质及提取的研究有较多报道【l】。 随着研究的深入，乳酸菌细菌素的应用前景越来越受到人们的关注，然而在细菌素 的研究中仍存在许多有待解决的问题，其中细菌素的提取目前还是个瓶颈。常用粗提细 菌素的方法有硫酸铵沉淀法和丙酮沉淀法。采用硫酸铵沉淀法不易破坏细菌素的生物活 等四种细菌素的吸附性进行提取f3】，现在吸附法己被广泛使用，但并非所有的细菌素都 有吸附性质。本文研究了丙酮沉淀法、乙醇沉淀法和pH吸附释放法三种粗提方法是否 适合于提取植物乳杆菌LP9细菌素，选出最适宜的一种，并对适宜的粗提方法进行优化。 1材料与方法 1．1菌种及培养基 细菌素生产菌株：植物乳杆菌，本实验室分离自东北泡菜； 指示菌：干酪乳杆菌，本实验室保藏。 所用培养基为MRS培养基 1．2菌种培养条件 菌株使用前在斜面凇S培养基中37℃下培养活化两次。植物乳杆菌在液体MRS m1 培养基中37℃下过夜培养，以1％接种量转接到150 MRS液体培养基中，30℃下静 置培养16 备用。 基金项目：国家高新技术研究与发展项目(863)(2006AAIOZ347) ’通讯作者：贾士儒．电话：022传真：022子邮箱jiashiru@tuSt．edu．cn 13琼脂扩散法测定抑菌活性 在无菌平皿中倒入10“左右融化的素琼脂(2％)，待其充分冷却凝固后，放入已 灭菌的牛津杯数个，并按一定次序排列整齐。将100ml固体MRS培养基融化后冷却至 50℃左右，加入指示菌液1砌，迅速混合均匀，用无菌移液管吸15111l上述培养基加入 放有牛津杯的平皿中，冷却后取出牛津杯。将待测液100 pl加入到牛津杯形成的小孔 中，37℃培养18h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。(牛津杯直径：7．74唧，本实验中以 能出现直径8．74姗以上的抑菌圈的物质记为有抑菌活性。)细菌素抑菌效价采用每ml 的任意单位(AU)来表示。一个任意单位AU被定义为：对细菌素溶液进行连续二倍 稀释，能够对指示菌产生明显抑菌圈的最大稀释倍数的倒数。 1．4植物乳杆菌素的提取 1．4．1丙酮沉淀法 心收集上清液，将上清液旋转蒸发至20“，不断向其中加入固体NaCl直至发酵液变为 NaCl的饱和溶液，按饱和溶液：正丙醇体积比为1：3的比例加入正丙醇，将混合液 1．4．2 pH吸附释放法 8000r／min离心30min收集上清液，重新调上清液pH值为6．0即得粗提液。 1．4．3乙醇沉淀法 乙醇并浓缩至原体积的1／5，即得粗提液。同时以未接菌的空白MRS培养基作为对照， 其余步骤同上，以排除乙醇影响。 2结果与讨论 2．1丙酮沉淀法 表l丙酮沉淀法提取LP9的抑菌活性测定 细菌素 沉淀质量(g) 抑菌圈直径(mm) 植物乳杆菌素LP9 0．016 8．22 65 由表1可知，所得粗提液抑菌圈