第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养.ppt

第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养 第一节 谷氨酸生产菌的主要特征 一、现有谷氨酸生产菌的分类 现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。 1.棒状杆菌属(Corynebacterium) 2.短杆菌属(Brevibacterium) 3.小杆菌属(Microbacterium) 4.节杆菌属(Arthrobacterium) 二、现有谷氨酸生产菌的主要特征 细胞形态短杆形、棒形； 革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢，不能运动； 需氧型微生物； 生物素缺陷型； 脲酶强阳性； 不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等； 发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变； 二氧化碳固定反应酶系强； 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱； α-酮戊二酸氧化能力微弱； 柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活性强； 具有向环境泄露谷氨酸的能力； 不分解利用谷氨酸，并能耐高谷氨酸，产谷氨酸8%以上； 第二节 国内谷氨酸生产菌 国内谷氨酸生产菌 （1）北京棒杆菌（As1.299） 突变株：7338、D110、WTH-1 （2）天津短杆菌（T613） 突变株： TG-961、FM-415、S9114、 CMTC6282 （3）鈍齿棒杆菌（As1.542） 突变株： B9、F-263 第三节 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化 一、种子的菌体形态 斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。 多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及V字形,有栅状或不规则聚块; 分裂的细胞大小为0.7～0.9*1.0～3.4μm。 由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。 （2）感染噬菌体后的形态 前期感染 细胞明显减少，形态不规则，发圆、发胖，缺乏八字排列，有明显细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网。 中后期感染 形态不规则，边缘不整齐，有毛刺，有细胞碎片。 第四节 谷氨酸发酵的代谢控制育种 （1）日常菌种工作 定期分纯 小剂量诱变刺激 高产菌保藏 （2）选育耐高渗透压菌种 耐高糖（20-30%） 耐高谷氨酸（15-20%） 耐高糖、高谷氨酸（20%+15%） （3）选育不分解利用谷氨酸菌株 以谷氨酸为唯一碳源菌体不能生长或微弱 （4）选育细胞膜渗透性好的菌株 抗VP类衍生物：香豆素、芦丁 选育溶菌酶敏感性突变株 选育二氨基庚二酸缺陷型 油酸缺陷型 、甘油缺陷型 温度敏感型 （5）选育强化CO2固定反应的菌株 以琥珀酸为唯一碳源生长快的菌株。 丙酮酸缺陷型 （6）选育减弱乙醛酸循环的突变株 选育琥珀酸敏感型、不利用乙酸突变株。 （7）强化柠檬酸到α-酮戊二酸代谢菌株 选育柠檬酸合成酶活力强的突变株 选育抗氟化钠、氟乙酸菌株 （8）解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 抗谷氨酸结构类似物 耐高谷氨酸 谷氨酰胺抗性菌株 酮基丙二酸抗性菌株 （9）强化能量代谢突变株 选育呼吸抑制剂抗性菌株，抗丙二酸、氰化钾抗性菌株。 选育ADP磷酸化抑制剂抗性菌株，2，4二硝基酚、砷抗性菌株。 寡霉素抗性菌株。 （10）减弱HMP途径后段酶活性的突变株 选育抗嘌呤、嘧啶类似物的突变株。 第五节 应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌 应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌 应用转化法选育谷氨酸生产菌 应用转导法选育谷氨酸生产菌 应用重组DNA技术构建谷氨酸工程菌 原生质体融合新技术 一、菌种扩大培养的任务 为发酵罐的投料提供纯而壮、相当数量的代谢旺盛的种子。 氨基酸生产菌一般用二级培养 第六节 菌种的扩大培养和种子的质量要求 二、菌种的扩大培养过程 斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐 （1）斜面菌种的培养 葡萄糖 0.1%，蛋白陈 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化钠 0.5%，琼脂 2.0~2.5%，pH 7.0~7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。 一般只移接三代 典型的分批发酵工艺流程图 成品 （2）一级种子培养 a.培养基组成 葡萄糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸镁 0.04%，磷酸氢二钾 0.1%，玉米浆 2.5~3.5%(按质增减)， pH7.0。 b.培养条件 500mL→ 1000mL →1000L 置于冲程7.6cm、频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度33~34℃。 一级种子质量要求 种龄：12h，pH值：6.4±0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查：(-)(双层平板法、划线法、