齐全版(荧光PCR技术).ppt

荧光实时定量PCR定量原理 PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期。起始DNA量越多扩增产物量便越早达到检出值，也就是扩增曲线越早起峰。我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少得顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模板的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图标示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，检测未知样品CT值，并将其代人标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是Real Time PCR的定量原理。 扩增曲线的描述 PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活，dNTP和引物的枯竭，反应副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，致使PCR并非一直呈指数扩增，而最终将进入平台期。 定量的分类 绝对定量方法：绝对定量方法相对简单。绝对定量是使用已知浓度的标准品制作标准曲线，对未知浓度的样本进行绝对量（拷贝数）测定的方法。 相对定量方法：相对定量方法相对复杂，一般用于基因表达解释。首先应分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对应参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较。 在扩增产物到达阈值线时： Xct=X0(1+Ex)Ct=Y （1）Xct：荧光扩增信号到达阈值信号强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为Y。方程式（1）两边同时取对数得： ㏒Y= ㏒X0(1+Ex)Ct （2）整理方程（2）得： ㏒X0=﹣㏒(1+Ex) *Ct+㏒Y （3）最后结论： ㏒X0与Ct呈线性关系，根据样品设置的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。 SYBR Green I 荧光嵌合法通常使用SYBR Green I。SYBR Green I是一种能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，荧光染料结合到双链DNA后荧光信号增加1000倍，通过荧光强度的检测，可以实时监测PCR扩增的产物量。 融解曲线：采用SYBR Green I荧光嵌合法检测时，可以通过融解曲线分析，确认PCR反应的特异性。溶解曲线分析是在PCR反应结束后，将PCR反应液的温度渐渐升高，实时监测SYBR Green I的荧光信号强度变化进行的。起初由于PCR扩增产物呈双链，具有较高的荧光信号强度，随着温度的渐渐升高，DNA双链渐渐打开，嵌入DNA中的SYBR Green I数量减少，荧光信号强度就渐渐降低，当双链DNA解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的温度即融解温度（Tm值），Tm值与PCR扩增产物的序列有关，对于某一PCR扩增产物，其值是固定的。 融解曲线的分析 理想的融解曲线应该只有单一峰型曲线。 如果出现两个或以上的峰型，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生，需要对反应条件进行优化或重新设计引物。 实时荧光PCR的理论基础 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。 TaqMan Probe法 TaqMan Probe法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能检出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。 当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交，进一步在PCR反应的延伸过程中，DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光，通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的，具体原理如下图： TaqMan探针 水解型 1.荧光素，淬灭剂 2.FRET（荧光共振能量传递） 3.识别特异性产物 优点 对目标序列特异性高 缺点 1.只适用于一个目标（特异序列） 2.价格较高（1000-2000元） 3.探针5‘端不能是G（切下后淬灭） 荧光化学监测方式总结 TaqMan MGB 探针法原理 在TaqMan探针的基础