内质网应激相关基因在自身免疫性疾病中的表达Expression of endoplasmic reticulum stress related genes in autoimmune diseases.pdfVIP

目 录 英文缩略词表 1 中文摘要 4 英文摘要 7 1 前言 11 2 实验材料 12 2.1 动物 12 2.2 菌株、细胞株及质粒 12 2.3 主要试剂 13 2.4 引物及siRNA 14 2.5 主要仪器与设备 15 3 实验方法 16 3.1 主要试剂溶液的配方 16 3.2 临床样本收集及处理 17 3.2.1 健康人及SLE、RA 及AS 病人外周血样收集 17 3.2.2 外周血白细胞分离 17 3.3 重组质粒的构建及质粒提取 18 3.3.1 引物设计及合成 18 3.3.2 样本RNA 的提取、定量 18 3.3.3 RT 反应cDNA 的制备 19 3.3.4 常规PCR 以及产物回收 19 3.3.5 凝胶DNA 片段的回收 20 3.3.6 DNA 连接 20 3.3.7 DH5α感受态细胞的制备 21 3.3.8 质粒转化 21 3.3.9 质粒的小量提取 21 3.3.10 重组质粒酶切及测序鉴定 22 3.4 使用SYBR Green Ⅰ进行Real-time PCR 反应 22 3.4.1 Real-time PCR 反应条件的优化 22 3.4.2 定量标准曲线的制备 23 3.4.3 重复性试验 23 3.5 临床病例资料的整理分析 24 3.5.1 病例对照分析 24 3.5.2 临床指标与实验结果相关性分析 24 3.6 细胞培养及转染 24 3.6.1 肿瘤细胞 24 3.6.2 原代细胞 24 3.7 淋巴癌细胞株中ATF6 基因沉默 26 3.8 统计分析 26 4 结果 26 4.1 临床样本的收集 26 4.2 定量PCR 方法的建立 29 4.2.1 目的基因引物设计结果 29 4.2.2 PCR 产物鉴定 29 4.2.3 重组质粒的筛选 31 4.2.4 定量PCR 反应条件的优化 32 4.2.5 定量PCR 曲线的建立 32 4.2.6 SYBR Green ⅠPCR 的重复性 34 4.3 SLE 、RA 及AS 患者外周血ER 应激相关基因的表达 34 4.4 ATF6-siRNA 的设计和验证 37 4.5 沉默ATF6 后降低EL4 对应激刺激的敏感性 38 4.6 UPR 基因表达水平与SLE 临床指标的相关性 39 4.6.1 SLE 病人临床指标之间相关性分析 39 4.6.2 SLE 、RA 中UPR 基因表达水平之间相关性分析 41 4.6.3 SLE 、RA 中UPR 基因表达水平与临床指标的相关性分析 42 4.7 丝裂原诱导的脾细胞活化与ER 应激有关 43 4.7.1 原代脾脏细胞分离及培养 43 4.7.2 脾细胞中丝裂原诱导的ER 应激相关基因表达 44 5 讨论 46 6 结论 49 7 本研究的创新点 50 8 参考文献 50 附 录 54 致 谢 55 综 述 56 英文缩略词表（Abbreviation ） 英文缩写 英文全称 中文全称 ACL Anti-cardiolipin Antibody 抗心磷脂抗体 AHA Anti-histonic Antibody 抗组蛋白抗体 ANA Anti-nuclear Antibody 抗核抗体 AnuA Anti-nuclesome Antibody 抗核小体抗体 ATF6 Activating Transcription Factor 6 激活转录因子6 AS Ankylosing Spondylitis 强直性脊柱炎 Immunoglobulin-heavy-chain BIP