己烯雌酚影响成年仓鼠睾丸一氧化氮生成及其与生精细胞凋亡关系的研究.pdfVIP

2004学术年会 囝。。， 己烯雌酚影响成年仓鼠睾丸一氧化氮生成及其与 生精细胞凋亡关系的研究+ 杨筱珍，陈耀星“，王子旭 中国农业大学动物医学院，北京100094 摘要：目的探讨在己烯雌酚(DES)诱发成年动物生精异常过程中，睾丸一氧化氮(NO)生 凋亡的生精细胞，苏丹III染色法检测睾丸曲精细管内脂滴分布的变化。结果DEs能明显提高NO的 合成并与细胞凋亡有密切关系。在1mg瓜g体重DEs剂量组，大量精母细胞和圆形精子细胞表达eNOS 和iNOS，并出现明显的细胞凋亡，凋亡生精细胞胞浆内线粒体呈髓样改变，并有大量脂滴分布于生 精细胞中NO含量的增加，引起生精细胞氧压的改变和脂质过氧化，可能是DEs诱发生精细胞过度凋 亡的主要原因。 关键词：二乙基己烯雌酚；生精细胞；一氧化氮；氧压：细胞凋亡 是雌激素样致内分泌紊乱剂。目前，已有研究表明，DES能象许多外源因素诱导生精异常中出现生精 细胞过度凋亡一样，诱发多种动物胚胎期及青春期雄性动物生精异常，我们前期研究发现DES还能 诱发成年动物生精细胞凋亡。但到目前为止，对它影响生精细胞凋亡程度及其作用机理如何还不清楚。 一氧化氮(No)是一种自由根气体分子，它是调节许多生理过程的信号分子。一氧化氮合酶(NOS) 其中前两者与正常生理状态生精细胞的退化和炎症因子诱导生精细胞的凋亡密切相关。目前已有许多 研究发现N0参与生精细胞发育及多种细胞细胞凋亡的过程，但对它在雌激素诱发的生精异常中的作 用如何还未见有报道。因此本研究将观察DES诱导成年仓鼠生精异常的过程中睾丸一氧化氮(NO)生 间的内在联系，为探讨雌激素样内分泌干扰物诱发的生精细胞凋亡机理提供基础资料。 1材料和方法 1．1动物处理 实验和对照组各10只。采用皮下注射分别给予实验低、中和高剂量组动物(以橄榄油作载体配成剂量 个体相应剂量的橄榄油。注射结束后断头处死动物，迅速取睾丸进行以下试验： ‘基金项目：国家自然科学基金资助30270960) ¨通讯作者，陈耀星(1965一)，男，福建泉州市人，博士后，教授，主要从事神经生物学及生殖免疫学研究工作。 作者简介：杨筱珍(1977一)，女，山东济南市人，在读博士研究生，主要从事生殖免疫学研究工作。 。。。囝 2004学术年会 1．2 NO含量的测定(硝酸还原酶法) 按NO检测试剂盒(购自晶美生物制品公司)说明书进行操作。NO含量的计算：一氧化氮(u umol，L。 mol／L)=测定管OD，标准管OD 1．3免疫组织化学染色和TUNEL染色 睾丸经Bouin’S固定液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、5“m厚连续切片。采用免疫组织化 学染色法进行染色。eNOS和iNOS一抗为兔源多克隆抗体(北京中山生物技术公司)，浓度均为1： 50，标本置湿盒内4℃，过夜。生物素化山羊抗兔二抗，室温孵育2h。辣根过氧化物酶标记链霉卵 白素(1：200)，室温孵育2h，DAB显色，呈色反应为棕色的示为阳性。 按细胞凋亡检测试剂盒(购自武汉博士德公司)说明书进行凋亡细胞(TUNEL法)检测。DAB 显色，细胞核呈棕黄色者为阳性细胞，即凋亡细胞。 1．4电镜观察 睾丸经戊二醛及锇酸固定，Spun-包埋剂浸透包埋，超薄切片，经柠檬酸双氧铀染色，GEOLl00S 型透射电镜观察。 1．5苏丹IIl中性脂肪染色法 染液染5min。Ehrlich氏苏木精复染2min。甘油明胶封片，镜检。 1．6数据处理 本实验对每只动物任选两张睾丸切片，随机选取组织结构保存较好的近圆形曲细精管约5-8个， 阳性精原、精母和圆形精子细胞的数量及所占生精细胞的百分比，同时计数每只动物100个曲精细 管中凋亡、eNOS和iNOS表达阳性管数(每管内有1个以上阳性细胞示为阳性管)，并分别计算免 Ttest进行统计学分析，实验 疫反应阳性管腔百分比。以上数据用SPSS软件的Independent-sample 结果用均数±标准差(x±s)表示，P0．05为差异有显著性。 2结果 2．1睾丸组织中NO含量的变化 pm