德保矮马耳缘组织成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究.pdfVIP

2004学术年会 囝599 德保矮马耳缘组织成纤维细胞系 的建立及其生物学特性研究+ 周向梅“，马月辉… 关伟军1，赵德明2 1中国农业科学院畜牧研究所，北京1000942中国农业大学动物医学院，北京100094 摘要：本试验采用组织块直接培养法，对德保矮马耳缘组织进行原代和继代培养，成功地建立 了成纤维细胞系。试验中对培养细胞了进行形态学、细胞生长动态学和重组绿色荧光蛋白在培养细 胞中表达的观察，以及核型和乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶两种酶的同工酶分析。结果表明细胞群体 谱与本室其它畜禽品种细胞系有明显差别；细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性；细胞转染绿色 荧光蛋白的效率较高，迭32．3％。该细胞系的建立，使德保矮马这一国家重要遗传资源在细胞水平 上得以保存下来，也为进一步基因组和体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。 关键词：德保矮马；耳缘组织；成纤维细胞系；生物学特性 随着全球生物多样性及其遗传资源丧失程度的加剧，使得各国都纷纷投入大量人力和财力，并 继保存了大量生物资源的培养物。 本试验是以我国国家级重点保护家养动物品种——矮马的耳缘组织为材料，体外培养和建立了 成纤维细胞系，并按照ATCC对体外培养物的质量控制标准进行严格检验和生物学特性的研究。主 要的宗旨是：一，使全球仅有的、非人工矮化而自然形成的、珍惜矮小马品种(成年马体高在106 厘米以下)的遗传资源在细胞水平长期保存下来，一旦灭绝可通过克隆技术使它们再现；二，确定 矮马耳缘组织成纤维细胞的部分生物学特性。 1材料与方法 1．1矮马耳缘组织的采取 用剪刀剪掉耳缘周围皮毛，75％酒精消毒后，用无菌剪刀剪取两匹雌性和三匹雄性矮马耳缘组 织约1cm2，然后置入含双抗的PBS中，1小时内带回实验室。 1．2矮马耳缘皮肤成纤维细胞原代培养、传代和冻存，活率计算和绘制生长曲线 +国家基础性工作重大专项(200IDEAl0006)．国家自然科学基金 author1 E-mail：Yuehuima@263net 十十通讯作者(Corresponding @cau 第一作者倚介周向梅．女．中国农业大学攻读博士学位。研究方向：动物基础病理学。E-mail㈣zhoueducn 600蟋莎 2004学术年会 1．3染色体分析 et 分裂相好的染色体数目，并依照文献报道方法制备核型(Forda1．1980)。 1．4同工酶分析 酸脱氢酶(MDH)或乳酸脱氢酶(LDH)同工酶进行染色(何忠效等，1999)，拍照。 1．5微生物污染检测 以验证。 1．6脂质体介导的绿色荧光蛋白(G FP)转染矮马耳缘组织成纤维细胞的检测 按照梁惠玲等人(1999)的方法进行。 2结果 2．1矮马成纤维细胞形态学观察 不同个体的组织块贴附半月左右，少量类上皮和类成纤维细胞从组织块周围移出生长。随时 间推移，大量类成纤维细胞从组织块周围迁出并迅速增殖，细胞呈典型的长梭形。至细胞达90％ 汇合时，进行消化传代和继代培养。细胞经传代之后，生长加快，3．4天细胞即可长满瓶底而再次 传代。 图1矮马耳缘组织块直接培养法培养的细胞 Fig·1CeilsculturedfromDebaoear tissue ponymarginalusingprimary explantstechnique cells)×100 A．原代细胞(pdmary B．传两代后的成纤维细胞(fibroblastcellssubculturedaftertwo passages)