微载体培养人皮肤成纤维细胞的代谢研究.pdfVIP

微载体培养人皮肤成纤维细胞的代谢研究 邓明安同燕华平谭文松 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237) 摘要：用微栽体培养人包皮成纤维细胞，比较徽栽体培养与传统方瓶培养的人皮肤成纤维细胞在葡萄 糖，乳酸和氨代谢以厦细胞形态和细胞生长方面的差异．微栽体培养所菝得的细胞产量在不换液的情 况下比方瓶培养高5倍．微栽体培养时换液比不换液高出l倍．微我体培养消耗的葡萄糖量比方瓶培 养高l倍，微巍体培养的乳酸积jI【量比方瓶培养高1倍．氨的积累在两种培养方式阃没有明显的差异． 选一黠果提示葡萄糖夸量和乳政积景量不是细胞生长的限帝J因素．可能存在一些算它因素f,／t母4了细胞 的生长． 关奠阐：微载体；细胞培养：代谢 大面积烧伤病人及足部溃疡病人很难用自体皮肤移植来进行治疗。早期治疗用尸体来源的皮 肤移植。但是尸体来源的皮肤有限、而且有传播疾病的危险。基于这些原因，各国竞相发展人工 皮肤。经过数十年的努力，已有几种人工皮肤成功地用于临床[1】。这些人工皮肤是由皮肤细胞和 不同的基质构成的，因此皮肤细胞的大量培养是构建人工皮肤的关键。 文献中报道的皮肤细胞培养方法有静态培养、灌注反应器培养【2】等。静态培养贴壁细胞时，因可 贴壁的表面积限制，细胞产量低，费时费力又不经济。灌注反应器培养的反应器结构复杂、操作 难度大。微载体培养细胞有操作简单，可贴壁的表面积大因此细胞产量大等优点。有人成功地用 微载体培养人角质细胞【3]。但是微载体培养人皮肤成纤维细胞还没有报道。 本研究尝试了微载体培养人皮肤成纤维细胞。从细胞形态学、细胞生长、细胞代谢等角度比较微 载体培养的人成纤维细胞和传统的静态培养人成纤维细胞。 1材料与方法 1．1材料 皮肤取白小儿包皮。培养基是含有10％小牛血清，1％青霉素和1％链霉素的DMEM。中性蛋 白酶和胶原酶是美国Sigma公司的产品。微载体(CT3)由本实验室自制。葡萄糖浓度测定试剂 盒和脲浓度测定试剂盒购自上海生物制品研究所。 1．2方法 1．2．1人皮肤成纤维细胞分离照参考文献[4】报道的方法，从人包皮组织分离。 速搅拌过夜。 104个细胞／m[的密度接种于28cm2的方瓶中．不换培养液连续培 1．2．3方瓶静态培养：细胞以5x 养。 1．2．4转瓶微载体培养：将预处理好的微载体转瓶取出，静置至微载体下沉，然后除去培养基，再 X 加入50mL接种密度为5 10‘个细胞／mL(接种第4代成纤维细胞)的新鲜培养基，放入37。C，5％C02 饱和湿度培养箱中以30rpm的转速进行培养。其中一组不换液，另一组换液培养。 1．2．5细胞贴壁率测定及贴壁动力学分析：微载体培养的当天每隔10min取样，取无微载体的悬浮 液，用血球计数板计数，确定微载体培养物中游离细胞的数目。微载体培养物中游离细胞减少的速 率决定了细胞贴附于微载体的速率。游离细胞减少速率按以下公式计算：Ct=Coe“·，Ct是时间为t 638 时的游离细胞浓度，co是起始细胞的浓度，k是一个固定常数。此公式可转化为：-Ln(c代。产kt． 其中常数k就表示了贴壁的速率[5】。 1．2．6细胞生长曲线测定：每天从培养的转瓶中取出少量微载体培养物，用结晶紫染色，血球记数 板记数。进行生长曲线的测定。 1．2．7细胞代谢测定：照公司提供的方法，用试剂盒渊定培养物中葡萄糖、乳酸和氨的浓度。 2结果 2．1细胞在微载体上的贴壁效率 细胞以5x10·细胞／mL接种于含有39，L的微载体培养基中，转瓶培养。2小时以后培养基中几乎 观测不出游离的成纤维细胞．说明细胞已全部贴附于微载体上。细胞在微载体上贴壁的速度非常 2．2微载体培养和方瓶培养的细胞生长比较 不换培养液的情况下，方瓶培养的成纤维细胞 生长的最大密度仅为1．3x105个细胞／mL，比生 长速率是0．06／天。同样条件下，用微载体培养