重组人胰高血糖素类多肽1（736）的质量研究.pdfVIP

中文摘要 重组人胰高血糖素类多U-1(7-36)是通过重组技术生产的由30个氨基酸组 成的具有促进胰岛素分泌的多肤，由上海华谊技术有限公司研究开发的国家一 类新药.其氨基酸序列为His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val- Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-AIa-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-AIa-Trp- Leu-Val-Lys-Gly-Arg-OH，为保证临床试验的用药安全及药品生产过程中的 质控，本文对其进行了质量研究。主要包括以下几方面: 一、重组人胰高血糖素类多肤-1(7-36)工作标准品的建立 采用HPLC和HPCE两种方法测定重组人胰高血糖素类多肤-1(7-36)的纯 度，结果均在98.5%以上;可将RP-HPLC和HPCE法作为质控中的常规方法来 测定样品的纯度。 通过测定N一末端氨基酸序列、分子量、元素组成、氨基酸组成及四大光谱 图等，对工作标准品的结构进行确证，结果，N一末端15个氨基酸的序列与已知 序列一致;测得分子量为3296.1与理论计算值3296.65Da一致;样品的核磁光 谱、紫外光谱和红外光谱均与理论一致;而元素组成及氨基酸组成经测定，均 在相对误差允许的范围内(10%). ，_、分别以V8酶及胰蛋白酶为蛋白水解酶，制备供试液，对水解的肤段以 C,$(0.46X25cm)为色谱柱，以。.01%TFA-H20-CH3CN为流动相，梯度洗脱， LC/ESI/MS法，同时得到UV-肤图及质量肤图，并对两种水解酶得到的肤段分 别进行归属，同时通过质谱碎片推测全部氨基酸序列。 对重组人胰高血糖素类多肤-1(7-36)的其它理化性质进行考察，为制定合理 的质量标准奠定了基础。 由于没有国际通用的标准品可以利用，本文选用氨基酸分析法和氮含量测 定法对其肤含量进行标定，将二者平均值与HPLC法测得的纯度的乘积作为 rhGLP-1(7-36)首批工作标准品的肤绝对含量。 二、重组人胰高血糖素类多肤-1(7-36)含量测定方法的建立及生物活性的测定 通过对流动相的种类、pH值、盐浓度、乙睛浓度及柱温的优化，建立了专 属性高、灵敏度好的HPLC含量测定方法以及有关物质测定方法。 用葡萄糖测定试剂盒测定了其生物活性。 三、重组人胰高血糖素类多肤-1(7-36)杂质的研究 对工艺中残留的杂质:高分子物质、宿主蛋白、外源性DNA、有机溶剂 (包 括TFA和乙睛)进行了检测，结果均在限度范围之内。 四、重组人胰高血糖素类多肤-1(7-36)稳定性研究 采用LC-MS法进行有关物质的初步鉴别。 分别以酸碱水解、光照、高温、高湿、过氧化氢氧化等处理方式制备含杂 质样品，采用RP-HPLC.HPSEC和HPCE法方法对可能存在的杂质:水解片断、 聚合体、氧化产物、脱氨组分等进行检测，以考察不同方法的专属性:采用LC-MS 法确证了两个酸碱降解片断，探讨了酸碱降解机理。 研究结果表明:RP-HPLC及HPCE法可检出酸碱降解片断，HPSEC法可检 出二聚体;酸碱降解的片断基本与文献报道一致。 通过稳定性试验，对重组人胰高血糖素类多肤-1(7-36)的稳定性进行考察， 为木品的生产、包装、贮存、运输条件的设计提供了科学依据。 ABSTRACT RecombinantHumanGlucagon-likepeptide-1(7-36)hasamolecularweightof 3297.68Da,consistsof30aminoacids,whichcanpromoteinsulinsecretion.Inorder toensurethesafeytandeffectivenessoftheclinicaltrial,itsqualitywasinvestigated. Thepaperincludesseveralpartsasfollows: PartIIdentitytestsofRecombinantHumanGlucagon-1(7-36) TodeveloptheRP-HPLCandHPCEmethodsintheseparationanddetectedthe puriytofsamples. Inthetests,theidentiyt