植物显微制片技术石蜡切片法.pptVIP

植物显微制片技术——石蜡切片法 南京师范大学 生命科学学院 在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前，必须根据植物材料的特性，采用不同的方法，对植物材料进行处理，把材料制成透明的玻片标本。根据材料的性质和制作法的不同，常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类，前者常用的有徒手切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡切片法、冷冻切片法等，其中以石蜡切片法最为常用。后者包括整体封藏法、涂布法、压片法等。 石蜡切片法 石蜡切片法是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列处理制成永久制片的方法。在研究植物的细胞、组织、胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。 石蜡切片法的一般流程为：取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片。 取材 用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。 取材的注意事项如下： （1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置对照材料。 （2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。 雌、雄蕊一般不需分割。 （3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时，需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植物细胞分裂活动较明显。 （4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）；对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率较低。 （二）固定 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。 良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。 常用固定液： 简单固定液 以一种化学药品配制的固定液。 ⑴ 乙醇 为凝固型固定剂。常用无水乙醇或95％乙醇。 ⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂。具强烈刺激性气味。纯净的甲醛为无色透明液体。固定用的浓度为4%-10％。 ⑶ 醋酸 为凝固型固定剂。为无色透明的液体，刺激性极强，低温下凝结成冰，故又名冰醋酸。 2. 混合固定液： 由几种试剂，适量配制而成。混合遵循原则：① 优缺点互补；② 膨胀与收缩相互平衡；③ 强氧化剂与还原剂应分别配置。 常用混合固定液有下列几种： ⑴ FAA 固定液（福尔马林－冰醋酸－乙醇） 广泛适用于根、茎、叶、花药、子房的组织切片，所以又称为万能固定液。一般固定时间不低于24 h。该固定液优点是在较低温度下（10℃左右）适用于材料的长期保存，可兼作保存液。并且固定的材料，不妨碍染色，但用于细胞学上的固定效果较差。 ⑵ 纳瓦兴(Navaschjns)固定液 1912年首创。适用于细胞学与组织学研究的切片观察。但渗透慢，不能长期保存；主要用于显示分裂相。 （三）抽气 植物材料内部多由于含有空气，导致固定液不能完全深入。材料投入固定液后需要立即抽气。以便让固定液有效透入材料组织中，并排除材料内气泡的干扰。 一般抽气时间为20-30 min。抽过气的材料在停止抽气，应沉入底部。 （四）洗涤 固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶，影响观察；有的还会继续作用，使材料变质等。因此，在使用材料时，需根据固定液的种类，用水、缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液。如：用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次。如用水洗涤，可将材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用纱布将管口扎紧，置于水槽内，进行流水冲洗。流水冲洗时间一般为12-24 h。 （五）脱水 材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分解。而且透明剂与水是不相混合的，不利于材料的透明和包埋等后期处理。因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能与其他有机溶剂互相替代。 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。 （六）透明 透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，可以将材料中的脱水剂置换出来，使石蜡能顺利进入材料中