球虫DNA疫苗研究.ppt

十 DNA疫苗免疫效果的评价 1 细胞免疫 T细胞功能检测 T细胞增值功能的检测 T细胞介导的细胞毒作用检测（杀伤试验） 细胞因子的检测 2 体液免疫 B细胞增值试验 抗体检测 抗体形成细胞计数 抗体滴度检测 十一 影响DNA疫苗免疫效果的因素 1 载体 （1）载体启动子 （2）质粒DNA中的免疫刺激序列 质粒骨架中存在一种具有回纹结构的非甲基化的六聚体。这些六聚体具有非甲基化的CpG基序。这些CpG DNA可刺激淋巴细胞，包括B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、T细胞等多种免疫细胞活化，诱导多种细胞因子产生 氨苄青霉素抗性基因中有2个这样的免疫刺激序列（ISS），而卡那霉素抗性基因中无此序列 （3）载体DNA中的免疫抑制序列 最近的研究表明，质粒中的某些CpG基序可以抑制免疫应答 十一 影响DNA疫苗免疫效果的因素 2 目的基因 3 接种途径和接种方法 4接种剂量和次数 5动物年龄 有人认为，动物年龄越大，免疫效果越差 十二 增强DNA疫苗免疫效果的策略 1 优化载体 2 与细胞因子联合 （1）注射DNA疫苗的同时注射细胞因子 （2）将DNA疫苗与编码细胞因子的质粒混合注射 （3）将抗原基因与细胞因子基因形成融合基因，克隆于真核表达载体，然后注射 3 使用免疫刺激DNA序列CpG ODN 4 与抗原蛋白联合应用 5 形成多价DNA疫苗 6 形成多表位DNA疫苗 第二部分 球虫DNA疫苗研究进展 一 克隆的抗原基因 1子孢子和裂殖生殖阶段抗原 球虫复杂的生活史导致球虫抗原成分必然复杂，不同发育阶段抗原的免疫原性也有所不同，许多研究显示，子孢子和裂殖生殖阶段的抗原具有良好的免疫原性，对诱导机体产生保护性免疫应答至关重要。近年来发现了如下一些具有良好免疫原性的抗原，有些已经对鸡球虫DNA疫苗的研制起到了巨大的推动作用 1 子孢子和裂殖生殖阶段抗原 (1) 微线蛋白 微线是一种具有分泌功能的细胞器，位于虫体的顶末端。柔嫩艾美尔球虫子孢子的微线含有11种蛋白，虫体侵入宿主细胞过程中，微线蛋白有助于球虫吸附在宿主细胞表面以及虫体的移动 1 子孢子和裂殖生殖阶段抗原 (1) 微线蛋白 EtMIC-1 是一种分子量为10万～11万的微线蛋白，是一种糖蛋白G相关蛋白，虫体在子孢子和裂殖生殖阶段表达该蛋白；除了前面提到的两种作用之外，Et-MIC-1还可能与裂殖子从裂殖体感染的细胞中脱逸有关，其他种类的球虫也有类似EtMIC-1的蛋白，在巨型艾美尔球虫中发现了一种和EtMIC-1相似的蛋白，与EtMIC-1有高度的序列同源性 EtMIC-2 是分子量为5万的酸性蛋白，试验表明：在子孢子入侵宿主细胞之前就可以检测到EtMIC-2，在被入侵宿主细胞的表面也可以检测到这种蛋白，但侵入细胞1h之后，在宿主细胞表面就检测不到该蛋白的存在 1 子孢子和裂殖生殖阶段抗原 (2 ) 折光体蛋白 子孢子和第一代裂殖子都含有折光体，它的功能还不是很清楚，只知道在子孢子进入宿主细胞之后，相邻的两个折光体就发生融合，在球虫裂殖生殖阶段，融合体又逐渐发生分裂，但在第一代裂殖生殖之后就检测不到它的存在 1 子孢子和裂殖生殖阶段抗原 (2 ) 折光体蛋白 SO7(GX3262) 是第一种被发现的折光体相关蛋白，分子量为2.6万 重组SO7蛋白免疫1日龄雏鸡，随后用柔嫩艾美尔球虫，巨型艾美尔球虫，堆型艾美尔球虫以及毒害艾美尔球虫四种球虫做攻虫试验，结果发现与对照组相比，免疫组的病变记分减少了50％ Pogonka等用SO7-沙门氏菌重组菌口腔免疫3周龄白来航鸡，两周后测到抗SO7的特异性抗体，抗体水平维持了6周 Eal A (烟酰胺核酸依赖转移氢化酶) 是分子量为10万的堆型艾美尔球虫折光体蛋白，它可能涉及到糖类的运输。 人工攻虫之后，与未接受疫苗免疫的对照组相比，接种了Eal A重组疫苗鸡群的球虫卵囊排出量减少了50％～70％，增重明显(P0．01) 1 子孢子和裂殖生殖阶段抗原 (3 ) 热休克蛋白(hsp) 是一大类普遍存在的糖蛋白，位于细胞质内的hsp参与蛋白质的生物合成、折叠和分泌；也有一部分hsp定位于线粒体中，粘附到新生成的尚未折叠的前体蛋白上，促进这些蛋白质在基质中的移行和再折叠。研究发现，当细胞处于不利环境中的时候，hsp的合成增加；球虫在侵入动