第五章体外培养的基本技术.ppt

1. 消化培养法 ? 主要用品： 人或动物的新鲜组织 0.25%胰蛋白酶 Hanks液 含10%～20%牛血清的培养液 眼科剪刀、眼科镊 吸管、培养皿、瓶和不锈钢筛网、计数板等。 初代细胞培养主要方法： 流程：（注意无菌操作） 1～5cm3新鲜组织用Hanks液漂洗2～3次 眼科剪将组织剪成约1mm3的小块 加30 ～ 50倍原组织块的0.25%胰蛋白酶液 温消化37℃，1～4h 或 冷消化4 ℃ ， 6～24h 不锈钢网滤过除去大块组织 所得细胞悬液500～1000rpm低速离心，5min 弃上清，加适量营养液（含血清），吹打均匀制成细胞悬液 计数（5×105个/ml），细胞密度过大时，补加营养液调整 37℃培养，注意PH值（7.2 ～ 7.4） 冷消化 例：乳鼠肾细胞原代培养 （1）准备工作： ? 培养用品消毒后，放在超净工作台内 紫外线消毒，做好各项准备工作. ? 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装 吸管等 ? 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死  ? 将小鼠放入盛有70%酒精的烧杯中数秒  ? 置超净工作台内 （二）取材： ? 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔。 ? 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱。 ? 取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中 ? 用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污。  ? 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，洗净血液为止。 （3）胰蛋白酶消化： ? 将洗净的组织块移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至0.5 mm 大小的组织块。 ? 加入10～20倍体积的0.25%胰蛋白酶，放入37℃水浴中消化30～60分钟，注意应每隔10～15分钟振摇1次。 ? 当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。 ? 加入1～2ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入无菌离心管中。 （4）离心及计数 ? 以800～1000r/min低速离心8～10min，超净工作台内开盖，取上清加入适量培养液，细胞计数后分装。 ? 在细胞瓶（板）上标明细胞名称，代数，日期。 ? 倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37℃培养箱中培养。 （5）细胞观察 ? 培养细胞每天观察，检查：A.污染与否? B.细胞生长状态 ? 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染；如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，4h内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成多角型。 ? 培养3～4天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界限清。 ? 由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。 胰蛋白酶消化培养法特点： 能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快长成单层。 尤其适用于培养大量组织，细胞产量高。 用于经常性小量培养工作稍显繁琐，易污染。 2．组织块培养法 ? 不用消化液 ? 尽可能剪碎 ? ?两种技术： 翻转干涸法（37℃温箱中） 薄层营养液培养法 2h（不超过4h) 小块相互距离以0.5cm为宜 37 加入培养液少许 小结 动物细胞的培养步骤： ? 切取拟培养的动物器官或大组织块  洗去血污 剔除多余成分切成约1mm3大小的组织块 将所有组织剪碎用于组织培养 蛋白酶溶液消化 机械方法吹打组织块?