核磁共振内标法定量分析丁二酰化天然多糖的羧基含量.docVIP

精品论文 参考文献 核磁共振内标法定量分析丁二酰化天然多糖的羧基含量 王莺 （南方医科大学基础医学院肿瘤研究所 510515) 【摘要】目的：探索核磁共振内标法定量分析丁二酰化天然多糖的羧基含量方法。方法：基于天然多糖核磁共振氢谱主要集中在化学位移delta;3～6 ppm之间，而在低场delta;7～10 ppm范围内没有任何干扰，因此我们通过引入在低场delta;7～10 ppm有信号的吡啶为内标，以吡啶对位上H（delta;8ppm）的积分面积为1，与丁二酰化天然多糖的丁二酰基的积分面积进行比较，计算出定量样品中丁二酰基的含量，进而推导出引入羧基含量。同时进行重复性和稳定性试验，测试该方法的实用性，并与气相色谱法进行对比。结果：应用核磁共振内标法能够成功测出丁二酰化肝素和丁二酰化葡聚糖中引入羧基的含量。重复性和稳定性试验表明，该方法具有稳定和灵敏的检出能力，与气相色谱法测定的结果基本相符，该方法简便易行，结果准确度高，是一个值得推广的定量方法。 【关键词】定量分析 核磁共振氢谱 内标法 丁二酰化天然多糖 羧基 【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）06-0014-02 天然多糖是由醛糖或葡萄糖胺通过糖苷键连接成的高分子化合物，主要来源于动物、植物等，具有多种生物学功能，如免疫调节、抗感染、抗肿瘤、抗凝血、降血糖和抗病毒等功能，同时由于其优良的生物相容性和生物降解性，进一步扩大了它的应用范围[1]。多糖分子中含有富含-NH2，-OH，可通过降解、硫酸酯化、酰基化、烷基化等引入活性官能团，而这些化学修饰的多糖，一方面能够通过引入的基团，增强其生物活性，另一方面还可能赋予其新的生物活性，因此化学修饰的多糖已经成为多糖研究的热点之一[2]。如壳聚糖烷基化改性，可赋予壳聚糖多种新的功能，羧甲基化壳聚糖能够有效诱导细胞毒性，N-羧甲基化壳聚糖能够抑制口腔细菌等[3,4]。有文献表明通过酰化反应修饰的许多天然多糖衍生物均具有较低的抗凝血活性，并具备抗HIV的生物活性，因此酰化多糖衍生物可应用于多个生物医药领域[5,6]。其中丁二酸酐与多糖的羟基反应，通过酰化反应生成丁二酰化多糖，在多糖分子中引入更多的羧基，可大大提高多糖的反应活性，这种丁二酰化多糖拓宽了它的应用范围，因此探索定量分析丁二酰化多糖羧基含量的方法，在整个研究工作中显得尤为重要。 基于此，我们选用丁二酰化肝素和丁二酰化葡聚糖作为研究对象，考察定量分析引入羧基含量的方法。由于多糖主要由糖醛酸和葡萄糖胺组成的重复单元，化学结构复杂，应用常规分析方法如紫外分光光度法，红外光谱法进行检测时，存在在测试范围干扰大，信号模糊等问题，给分析测试带来一定难度，而这些重复单元在核磁共振氢谱的化学位移主要在delta; 3～6 ppm之间，因此我们可以利用多糖在低场范围（delta; 7～10 ppm）内没有任何干扰，通过引入在该范围有信号的内标，与丁二酰基积分面积进行对比，进而计算出羧基的含量，探索定量分析丁二酰化多糖的羧基含量的方法。 1 材料与方法 1.1材料 O-丁二酰化肝素和O-丁二酰化葡聚糖（自制）；吡啶（sigma）；氘代重水（99.8% D，美国，CIL公司）；Varian INOVA-400型核磁共振仪（美国瓦里安公司），天美7890气相色谱仪，FID检测器； 1.2方法 1.2.1核磁共振内标法样品制备 准确称取定量的吡啶于10 mL容量瓶中，用氘代水溶解并定容，制备成吡啶内标液。定量称取丁二酰化肝素和丁二酰化葡聚糖于直径5 mm核磁管中，加入一定量的吡啶内标液，超声静置，待样品完全溶解均匀即可进行1H NMR测试。 1.2.2 气相色谱法样品制备 向装有定量酰化多糖（500 mg）的试管中加入5 mL正丁醇，慢慢滴加1 mL 浓H2SO4，边滴加边摇匀，封管加热1小时后，加入氯仿及内标物，用蒸馏水清洗，倾去上清液，置10mL容量瓶中，用氯仿稀释到刻度，摇匀，作为供试样品。对每个酰化产品，做3个平行前处理样，力求去除前处理的不稳定因素对酰化度造成的影响。色谱条件：毛细管柱：HP-5MS，0.25mmtimes;30mtimes;0.25mu;m；进样口温度为200℃，分流比为1:2，总流速为10.9mL/min，载气为氢气，柱箱50℃保持1min，然后以30℃/min升至200℃，保持6min，在以20℃/min升至240℃，总运行时间34min。以乙酸乙酯为内标。 2 结果与讨论 2.1 羧