ELISA的基本原理1PPT.pptVIP

洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20（聚山梨酯 ）。 洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。 标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。 RF吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间接ELISA方法需要使用RF吸附剂去除类风湿因子的干扰作用。 结果判断 S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 S/N或P/N：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或 P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut -off值而已 。 注意事项 临床标本的收集和保存 ELISA测定中试剂准备 加血清样本反应试剂 温育的时间与温度 ELISA测定的洗版 显色 比色 结果的判定 ELISA的操作要点 严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。 严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 检测麻疹/风疹IgM抗体方法介绍 间接法 血清预处理 ELISA间接法 使用RF吸附剂 类风湿因子（10％）是一种自身抗体，主要有IgM组成，能与抗原抗体复合物的FC段结合，非特异性IgM抗体（风湿因子）的存在将导致IgM检测出现假阳性结果。 麻疹IgG 麻疹 抗原 麻疹IgM 抗人酶标 IgM抗体 类风湿因子 阳性结果 假 阳 性 结 果 另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。 麻疹IgG 麻疹 抗原 麻疹IgM 酶标抗人 IgM抗体 阳性结果 假阴性结果 * ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 重庆市疾病预防控制中心 彭靖尧 背景―免疫标记技术 免疫标记技术 原理：利用抗原抗体反应的原理，于抗原或抗体上加载各种标志物，抗原抗体反应中加入标志物示踪，利用标志物的可测量性来达到快速、敏感地检测各种体内微量生物活性物质。 特点：特异性、专一性、高效性。 发展 1941年 Coons建立荧光抗体技术 1959年 Yalow 和Berson创建放射免疫分析 1971年 Engvall和Perlaman以及Weeman和Schuur 用酶代替放射性核素制备了酶标记物，创立了酶免疫分析技术 酶免疫技术的要点 固相载体 酶和底物 试剂工作条件的选择 试剂条件的选择 主要是最佳工作浓度的选择 防止本底高、灵敏度低 常用棋盘法 酶联免疫吸附测定——ELISA 是在酶免疫技术上发展起来的 固相酶免疫测定 抗原（抗体）结合到固相载体表面 标本和酶标抗体（抗原）与固相上抗原（抗体）反应 洗涤、加酶反应底物，通过被酶催化产生的颜色及吸光度值定性、定量 ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay ——酶联免疫吸附实验）是20世纪60年代发展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。 ELISA的特点： 敏感度和特异度较高，重复性好。 试剂比较稳定，易于保存。 操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。 易于标准化和对检测对象进行定量。 可以自动化。 ELISA的基本原理 抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。 将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。 　 抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。 ELISA的种类 测抗原：竞争法、双抗体夹心法。 测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法 ELISA的种类 检测抗原： 竞争法 ELISA——标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中的抗