胶原凝胶法同步构建组织工程复合人工皮肤研究.pdfVIP

吉林省第三届科学技术学术年会 927 胶原凝胶法同步构建组织工程复合人工皮肤 章培标1 侯 宜： 侯立中2 周余来2 杨同书2 颜炜群2 曲福军2 (1中科院长春应化所长春130021；2吉林大学长春 130021) 摘要：为缩短组织工程皮肤体外构建时闻，适应临床皮肤移植的实际需要，我们建立了以胶原凝胶 法体外同步构建具有表皮和真皮结构组织工程皮肤的新方法。手术获取成年兔自体皮肤组织块，分离角 增．将培养的Fb混入胶原凝胶形成真皮层，同时接种Kc，在双倍ca2+的无血清培养液中培养3d，升至气 液界面培养i周。结果表明，该人工皮肤有一定的弹性和韧性；组织学观察，可见表皮和真皮双层结构，表 皮层连续，由2。3层Kc组成，可见规则排列的基底细胞和少量角化物形成，真皮层内可见散在或聚集分 布的Pb，与胶原纤维互相连结成网状，生长状态良好。提示，凝胶法同步构建组织工程皮肤可大大 缩短体外过程，在新型敷料的支持下，甚至可直接应用于自体移植修复。 关键词：人工皮肤肢原 组织工程 随着组织工程技术的发展，人们逐步开发了一系列可以以自体皮肤细胞构建的组织工程人工皮肤， 包括人工表皮、人工真皮和具有表皮和真皮结构的组织工程复层皮肤。对于大面积深层皮肤缺损患者，应 用人工表皮和人工真皮进行移植治疗均存在明显缺陷。而组织工程复层皮肤，目前被认为是最理想的皮 肤替代物，而成为人们研究热点”“f。我们研究室从1993年开始也先后构建成功了大鼠和人类的组织工 程复层皮肤，并在动物移植试验中取得较好的修复效果。然而，阻碍组织工程皮肤l临床应用的一个主要原 因是体外构建时间过长，不适于临床烧烫伤患者应急治疗的需要。如何缩短组织工程皮肤体外构建过程， 是亟待解决的问题。本研究尝试新的构建体系，以胶原凝胶法同步构建具有表皮与真皮结构的组织工程 复层人工皮肤，缩短体外构建过程，使之更适合于组织工程人工皮肤的临床应用。 1 材料和方法 1．1材料 1．1．1 试剂 酶购自SIGMA；胰蛋白酶购自HYCLONE；透明质酸(国产)。 1．2．2设备器材 产)。塑料培养板(皿)【Nune)。 1．2．3实验动物 日本大耳白兔，来自长春208医院。 1．2方法 1．2．1皮肤Kc和真皮Fb的分离、培养 取4月龄成年兔，一侧耳前部硫化钠脱毛，二天后0．3％戊巴比妥钠麻醉，超净工作台内强力碘局部 928 振兴吉林老工业基地—一科技工作者的历史责任 消毒，铺布，血管钳夹住耳部近端动静脉，手术切下2crux 2cm耳组织块，局部烫灼止血。标本置于小平皿 单层。Fb添加1 接种后30rain—lh后首次换液，以后每隔一天换液一次，1周后进行传代培养。 1．2．2 组织工程复层皮肤的构建 待细胞扩增至一定数量，分别消化获取4代以前的Kc及Fb。按如下方法构建复层人工皮肤： 真皮层构建：消化获取的Pb计数后，离心，弃上清。冰浴上取0 NaOH调PH至7．2—7 生牛血清l份及少量透明质酸混合，以2M 4，将凝胶混合物加至离心管内轻轻与 孔板内，于37℃孵育15～30rain至胶原凝胶形成。 K．SFM完全培养液5％COz37。C培养三天，换成含双倍钙离子浓度的K． 一Fb混合凝胶载体上，添加5mi SFM，升至气液界面培养1周。 1．2．3大体观察 每El于镜下观察人工皮肤内细胞生长状况。定期测定人工皮肤的收缩情况。 1．2．4组织形态学观察 取上述培养的复层人工皮肤作病理和电镜及相关检测。 2 结果 2．1大体观察 以胶原凝胶法培养的人工皮肤，随着Fb在胶原凝胶内扩增并通过分泌自身的胶原和其它基质蛋白， 形成新的真皮基质，同时出现较明显的收缩现象，其收缩程度与胶原的浓度、凝胶成分及细胞密度有关。 采用胶原凝胶法构建的自体组织工程复层皮肤。通过添加透明质酸等成分，调整凝腔内的细胞密度及胶 原浓度，以尼龙网作为支撑物，其收缩性已明显降低。培养的人工皮肤半透明，表面有～层膜状物，肉感较 强，有一定的弹性和韧性，可被镊子