腈水解酶基因的修正及与透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母与烟草中的联合表达研究.pdfVIP

摘 要 杂草与农作物竞争水分、养料和光照，影响农作物的产量、品质，还是许多病害的 中间寄主或越冬场所，通过除草剂来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分。但 除草剂在消灭杂草的同时也对作物产生了伤害作用。目前，利用基因工程手段培育抗除 草剂的转基因作物品种为解决这一矛盾提供了一条途径。 广谱、非选择性触杀型除草剂澳苯睛主要用来清除田间阔叶类杂草，它的作用机理 是能够阻滞光合电子的传递，使植物光合作用受阻而致死。从土壤细菌中分离得到了一 种以溟苯睛为氮源的菌株 (Klebsiellaozaenae)，它可以产生专一的澳苯睛水解酶，将澳 苯睛转变为无毒的3,5一二澳一经基苯甲酸。编码此酶的bxn基因也已经被克隆，并在 小麦、油菜等植物中成功表达。本实验室通过协议获得携带bxn基因表达盒的质粒 RD127，但连续两年转化棉花未果，分析序列发现存在4处变异。故本实验首先采用PCR 法对bxn基因的突变点进行了回复突变，并借助酵母表达体系检验回复突变后的基因是 否具有睛水解酶活性。 来源于贫氧环境中的一种专性好氧菌 Vitreoscilia的血红蛋白能够在极低的溶氧 C5%)条件下促进生物体的生长。经过密码子优化的透明颤菌血红蛋白基因(1ztreoscilla hemoglobingene)可以提高真核生物的产量、增加其生长速度本实验室已经证实，故在 本实验中被应用。 在酵母实验中，对Invitrogen公司的巴斯德毕赤酵母表达系统进行了创新性应用: 只用一种分泌型表达载体构建了可以同时在酵母胞内和胞外分泌表达的载体 pPIC9K-vgbbxn。此载体转化酵母后，通过PCR,SDS检测证实两基因己经很好地 整合进酵母基因组且能高效表达，以及用准确的酶活测定方法成功地检测到二者所表达 的产物均具有正常的酶活性。贫氧条件下对菌体的生长速度和密度进行了实验检测，发 现在贫氧环境中vgb基因可以基本保证毕赤酵母的生长;同时，对bxn基因的产物睛水 解酶也进行了检测，发现在vgb基因的存在下即使在贫氧中仍能保证睛水解酶的正常表 达且还可能过量表达。 接下来通过借助pGQ4A中间载体构建了两种植物表达载体pBI121-vgbbxn(一种 是vgb和bxn均由35S启动子启动;另一种是bxn由RuBP启动子启动，vgb由35S启 动子启动)，利用农杆菌介导法将两种植物表达载体导入烟草基因组。通过对烟草基因 组的PCR鉴定和转基因烟草的澳苯睛除草剂抗性检测证实:bxn基因已经整合进烟草基 因组并成功表达:用测定叶绿素含量的方法证实vgb基因也已经表达。并通过提取烟草 叶片粗蛋白降解澳苯睛使其透明的方法确定了RuBP启动子比35S启动子在植物叶片中 启动基因的熊力更强一些。 总上所述，本实验中构建了两种双价植物表达载体和一种可以解决毕赤酵母高密度 发酵中氧气供求矛盾、提高外源蛋白产量的酵母表达载体。此为获得新型抗除草剂转基 因烟草和毕赤酵母高密度发酵的产业化奠定了基础。 关键词:睛水解酶 透明颤菌血红蛋白(VHb) 毕赤酵母 双价表达载体 高效分泌表达 Abstract Weedscompetewithcropsformoisture,nourishmentandlight,moreover,theyarehosts ofdiseaseortheplacewherediseasesurvivesinthewinter,whichinfluencestheoutputand qualityofcrops.Itisindispensableformodemagriculturetocontrolweedsbyusing herbicide.Butherbicidealsoinjurescropswhilekillingweeds.Atpresent,cultivating herbicideresistantcropsbygeneticengineeringhassolvedthiscontradiction. Thebroad-spectrum,nonselectivecontactherbicidebromoxynilcankillweedswhose mechanism istoblockadetransmissionofphotoelectronandmakethephotosynthesis obsturct,thuscauseddeath.